D AOC CIO CELLES OS 2 IT

cm* 1° Solution alcoolique M ...... TO ie Me 2#Solutiontaqueuserde Az OK AT eme suce 3 SA cidechIor IV IDIMeDURAR UD ET E RCE 2 LIT. 1° Solution alcoolique au 3555 d'acide indol-3-acétique pur desséché dans le vide sur acide sulfu- RUE ER CC 0.

DAICOOIAO 07 RS ES Sn Er 5 3S6lution agueuse.de AZO2K à445.:......,.... eV 4% cidexchlorhydrique pur à1220B%7.... 0... 2

nc J'ai laissé reposer 15 minutes ces trois liqueurs, puis Je les ai examinées au colorimètre.

J'ai obtenu les résultats suivants :

Culture de Proteus.

Acide indol-3-acétique pour 100% de GQULTUR EL EE PE RE PRES Sc 0,0217 04%,0800 Poids de tryptophane lui corres- PORTANT (CNIDOUREOON) PE Er EEE 12,6 46,6

Les deux Proteus ont donc bien attaqué le tryptophane. Le Proteus M n’a pas formé d'indol dans les conditions que je viens d'exposer, mais a donné de l’acide indol-3-acétique dans la forte proportion de 46,6 pour 100 de la quantité correspondant à l’aminoïque employé; au contraire le Proteus V qui a donné une forte proportion d’indol n’a produit que peu d’acide indol-3acétique : 12,6 pour 100 de la quantité correspondant au poids du tryptophane introduit dans le milieu.

Mes microbes attaquent donc assez différemment le tryptophane au double point de vue qualitatif et quantitatif, ainsi que le montre le Tableau ci-dessous :

Pour 100.

Tryptophane correspondant à l'indol formé. 53,7 0 Tryptophane correspondant à l’acide indol- ACOHQUEN ORNE RL eRe ES 12,6 16,6

Il n'y a cependant pas lieu d’attacher à ces diflérences une trop grande importance en raison de la variabilité toute particulière du pouvoir indologène du Proteus, variabilité amplement établie, ainsi qu'on le verra plus loin, par les recherches de A. Berthelot et les miennes.

Bien entendu, il aurait fallu doser dans les deux cultures l’acide indol-5-carbonique qui y existait en faible proportion; j'aurais dû également Lenir compte de la substance colorante très abondante avec le Proteus M et qui avait certainement pour origine le tryptophane, car je ne l’ai obtenue que dans les milieux de cullure préparés avec cel aminoïque. Mais, comme depuis les travaux de Herter, ce sont surtout l’indol et l'acide indolacétique dont s'occupent les bactériologistes jai négligé les autres composés indoliques, produits d’ailleurs en quantités peu importantes.

Es —

On m'objectera peut-être que J'aurais pu doser dans mes cultures le tryptophane résiduel. Je ne lai pas fait pour deux raisons : la première c’est que je ne disposais que de très petits volumes de liqueur de trop faible concentration pour tenter une déterminalion pondérale ; la seconde, c’est que le dosage colorimétrique par le p-diméthylaminobenzaldéhyde n'aurait donné que des résultats par trop approximatifs, la teinte fournie par les cultures, même épuisées à l’éther et filtrées sur bougie, étant très différente de celle obtenue avec une solution aqueuse de tryptophane. Le point important de mes recherches était surtout de montrer que mes deux Proteus altaquaient le tryptophane, l’un très énergiquement, désagrégeant la molécule jusqu’à l’indol, l’autre arrêtant son action au stade acide indolacétique, car aucun microbiologiste, tant soit peu au courant de l’extrême variabilité biochimique de certains microbes et du Proteus en particulier, ne saurait voir dans la seule absence ou présence d'indol un caractère suffisant pour classer, dans deux espèces distinctes, deux germes que ne différencieraient pas plusieurs autres caractères biochimiques ou morphologiques plus importants.

La question de la fonction indologène des microbes, même considérée au point de vue spécial du Proteus, mérite de retenir particulièrement l'attention, non pas tant par son intérêt pour la distinction des espèces microbiennes, mais surtout parce que l’examen des publications qui la concernent et des discussions qu'elle soulève montre comme il est regrettable que tant de bactériologistes, ignorants des progrès de la Chimie biologique et des principes fondamentaux de l’analyse chimique, s’obstinent à ne pas adopter les méthodes rationnelles que recommandent les chimistes spécialisés dans l’étude des cultures microbiennes.

Lorsqu'il a publié ses recherches sur la production d'indol par le Proteus, À. Berthelot a donné de cette question un historique que je crois devoir reproduire en entier avant de montrer combien mes observations confirment celles des microbiologistes qui ont étudié le Proteus en mettant à profit les travaux des biochimistes. Voici donc dans quels termes s'exprime cet auteur :

« Ainsi que je le disais au début de ce Chapitre, les bactériologistes q ui ont étudié le Proteus vulgaris ont généralement négligé V. M. D

la recherche du phénol dans les cultures de ce microbe. Par contre, toute leur attention s’est portée sur l’indolet, depuis Lewandowski, ils ont toujours considéré la faculté de produire cette substance comme l’un des plus importants caractères du microbe de Hauser. En 1900 Feltz (56) étudia même assez complètement ce point de la biochimie du Proteus. Il eut l’heureuse idée de tenir compte des indications de Grimbert (57) sur la variabilité de composition des peptones, el il montra qu'une même race de Proteus peut produire de l'indol aux dépens de certaines de ces préparalions et ne pas en donner avec d’autres. Ses recherches qui portèrent sur quatre échantillons furent donc faites dans de meilleures condilions que celles de ses devanciers; elles aboutirent à cette conclusion que le Proteus vulgaris se comporte toujours en producteur d’indol lorsqu'on le cultive dans un milieu préparé avec une peptone convenablement choisie.

» Deux ans plus tard Tissier et Martelly examinèrent un Proteus isolé de viande en putréfaction; ils trouvèrent qu'il produisait de l’indol même dans les cultures sur bouillie de viande.

» La constance du caractère biochimique qui nous occupe semblait assez bien établie lorsqu’en 1906, A: Steensma (58) remarqua que le distillat des cultures de certaines races de Proteus ne contenait pas d’indol, alors que les cultures mêmes prenaient une coloration rose par l’addition de nitrite de potassium et d'acide sulfurique.

» On ne prêla pas attention à ces faits pourtant intéressants et cinq ans après Herter et Ten Broeck n'en tinrent aucun compte quand, après avoir examiné seulement deux races, ils publièrent que le Proteus cultivé dans une solution de peptone de Witte (1 pour 100) et d'extrait de viande Liebig (0,4 pour 100) produit un peu d’indol et une quantité notable d'acide indolacétique.

» Dans un travail paru à peu près à la même époque que celui de Herter, Cantù considère ce microbe comme un producteur d’indol et, bien qu'il en ait étudié plus de 180 échantillons, il ne dit pas en avoir Lrouvé qui n’ail pas ce caractère.

» En 1912, Louis Gauthier (55) se basant sur l'examen de deux races, publia que les cultures de Proteus dans une solution de peptone pancréalique contiennent toujours de lPindol au bout de 12 heures.

» Enfin quelques mois plus tard, J.-J. van Loghem et J.-C.-W.

Gras van Loghem-Pouw (39), après avoir étudié 30 échantillons, contirmèrent les résultats obtenus par Steensma et crurent bien faire de considérer comme représentants d’une espèce à part, Bacillus proteus antndologenes, les Proteus vulgaris ne donnant pas d’indol,

» En présence d'une telle confusion, il m'a semblé utile de déter-

miner, d’une manière aussi précise que possible, quelle est la

valeur réelle de la fonction indologène en tant que caractère spécifique du Proteus vulgaris. Pour cela, j'ai fait porter mes recherches sur les 61 Proteus dont je disposais.

» Avant d'exposer le détail de mes expériences, je crois bon d’insister quelque peu sur Les procédés que j'ai employés pour déceler la présence de l’indol dans les cultures microbiennes.

» Jusqu'à ces dernières années, pour caractériser cette substance, les bactériologistes utilisaient généralement une réaction basée sur la formation de nitroso-indol. Cette réaction se pratique le plus souvent suivant la technique adoptée par Kitasato (60) lors de ses premières recherches sur les microbes indologènes, c’est-à-dire qu'à 10°" de culture en bouillon ou en eau peptonée on ajoute 1°% d'une solution aqueuse de nitrite de sodium ou de potassium à 0,2 pour 1000, puis quelques gouttes d’acide chlorhydrique à 22° ou d’acide sulfurique à 66°. Une coloration rouge ou rose indique la présence d’indol; la sensibilité de la réaction peut être accrue en rassemblant dans l'alcool amylique le nitrosoindol formé.

» Bien que ce procédé de recherche soit encore employé très fréquemment, depuis 1901, on tend de plus en plus à lui substituer la réaction d’'Ehrlich au p-diméthylaminobenzaldéhyde qui est d’une extrême sensibilité (61). Dans les laboratoires de bacté-

DE bunecnle

riologie on l’effectue généralement en ajoutant, à 10 ture en bouillon ou en eau peptonée, quelques centimètres cubes d’une solution alcoolique de diméthylaminobenzaldéhyde à 2 pour 100, puis avec précaulion quelques gouttes d’acide chlorhydrique ou d’acide sulfurique concentré. Certains expérimentateurs croient utile d’ajouter un persulfate où un nitrite alealin ou de faire la réaction à chaud.

» Bien d’autres réactions permettent, comme on le sait, de caractériser l’indol, mais je ne m'en occuperai pas ici, car leur emploi est rarement utile dans le cas qui nous occupe. Je préfère m'en

Core

tenir aux deux que je viens de citer et montrer combien la valeur des résultats qu’elles fournissent dépend des conditions dans lesquelles elles sont effectuées.

» Pendant longtemps on s’est contenté d'ajouter directement aux cultures du nitrite de sodium et de l’acide, puis, pour déceler les très petites quantités d’indol, on eut l’idée de caractériser ce composé non plus dans les cultures même, mais dans leur disullat. Cette manière de faire avait en même temps l’avantage de supprimer une importante cause d’erreur surtout avec les réactifs modernes ; avec elle on évitait de pratiquer la recherche de l’indol en présence de certaines substances qui existent dans les cultures et qui peuvent donner lieu à des colorations génantes. De nombreux auteurs, et notamment Steensma, montrèrent l'intérêt qu'il y avait de préférer à toute autre technique la distillation des cultures; pourtant celle-ci ne méritait guère, ainsi que nous allons le voir, la confiance qu'ils lui accordaient.

» Porcher et Panisset (62) ont établi, en effet, que dans les cultures microbiennes, même d’espèces ne donnant pas d'indol, peuvent se former certaines substances, qui ont comme caractère commun de se décomposer facilement en donnant de l'indol; or l’une d’elles, l’acide indolcarbonique, se dissocie même ‘lorsqu'on porte simplement sa solution aqueuse à l’ébullition. La présence de tels composés indologènes rend donc illusoire la précaution que l’on prenait de distiller les cultures et, pour extraire l’indol qui peut se trouver dans celles-ci, il apparaît indispensable d’avoir recours à d’autres procédés qu’à l’entraînement par la vapeur d’eau. Celui qui convient le mieux est certainement l'épuisement des liquides à analyser par l’éther convenablement purifié.

» Porcher et Panisset ont donc eu le mérite de révéler une grave cause d'erreur dans l'étude de la fonction indologène des microbes et de rappeler en même temps aux bactériologistes qu’on ne doit jamais caractériser directement un corps dans une culture microbienne. Malheureusement leurs conseils n’ont pas été suivis comme 1ls le méritaient, à tel point que les résultats obtenus par Steensma, en 1906, sont sûrement plus près de la vérité que ceux publiés dans nombre de travaux récents.

» En eflet, certains auteurs, ennemis de ce qu'ils appellent dédaigneusement des complications, considèrent comme très suffisant

Oo —

de rechercher l’indol en pratiquant la réaction d’'Ehrlich directement dans les cultures. Pas plus qu'ils ne s'inquiètent des recommandations de Porcher et de Gauthier, ils ne tiennent aucun compte des travaux de nombreux chimistes (63) qui ont montré que le diméthylaminobenzaldéhyde donne avec diverses snbstances, existant normalement dans la plupart des cultures microbiennes et même dans certains milieux stériles, des colorations très difficiles à distinguer de celles que produisent l'indol et le scatol.

» Il n’est d’ailleurs pas besoin de connaître les travaux que je viens de signaler, pourse rendre com pte des précautions qu'impose l'usage du diméthylaminobenzaldéhyde; il suffit de se conduire en expérimentateur consciencieux et de ne pas adopter un réactif aussi sensible sans avoir vu ce qu’il donne avec des milieux témoins. Siles auteurs dont je parle plus haut avaient pris ce soin, ils auraient vu que certains milieux usuels et les solutions de cerlaines peptones, stériles ou ensemencés avec des microbes non producteurs d'indol, donnent, lorsqu'on les traite directement avec le réactif d'Ehrlich, des colorations très variées allant du bleu au rouge groseille en passant par toutes les teintes du violet. Je veux croire qu’en présence de constatations de cette sorte ils n'auraient pas adopté une telle manière de procéder et auraient cherché un moyen d'éviter des causes d'erreur aussi évidentes. Il faut croire toutefois que la nécessité des témoins et des expériences à blanc n'est pas encore admise par tout le monde, car j'ai eu maintes fois l’occasion de voir employer le procédé simpliste dont, après tant d’autres, je viens de montrer les inconvénients (!).

» Quoi qu'il en soit, lPexemple est assez curieux des mauvais résultats que peut donner, lorsqu'elle est utilisée sans précaution, une méthode excellente et très sensible. Il est pourtant bien facile; ainsi qu'on le verra plus loin, d'appliquer correctement la réaction d’'Ehrlich etd’en obtenir des résultats ne prêtant guère à discussion. Bien entendu toutes les réserves que je viens de faire ne s’appliquent qu'aux travaux récents et, pour idenufier des microbes

(1) On trouvera dans un travail de H. Seidelin et Fr. Lewis [ Some notes on indole-reaction and allied phenomene (Journal of Hygiene, décembre xg11, p. 204) ] un exemple des pertes de temps, des incertitudes et des difficultés d’interprétation auxquelles expose la méconnaissance des faits révélés par Neubauer, Cole, Rhode, Porcher, Steensma et Gauthier.

SANTD Eee

appartenant à des espèces décrites depuis longtemps comme productrices d’indol, il faudra toujours se servir du procédé au nitrile tels que l’utilisaient les anciens auteurs, quitte à compléter ou à corriger leurs observations en faisant des témoins et en employant des méthodes plus rigoureuses.

» Avant d'exposer le détail de mes expériences, il me paraît utile de rappeler brièvement que la production de l’indol par certains microbes est due à leur action sur le tryptophane qui existe dans la molécule de la plupartdes albuminoïdes (1), On en a d’ailleurs une preuve indirecte en cultivant des espèces indologènes fortement protéolytiques dans un milieu où la gélatine représente le seul élément protéique; celle-ci ne renfermant pas de tryptophane on ne trouve pas d’indol dans les cultures.

» Ainsi que l’ont montré Hopkins et Cole (64), la production d’indol et de scatol aux dépens du tryptophane est le résultat d’une attaque progressive au cours de laquelle apparaissent divers corps de plus en plus simples; ces termes de passage sont l’acide indolpropionique, lacide indolacétique et l'acide indolcarbonique. Depuis que l’on sait définitivement que le tryptophane est l’acide indolaminopropionique on s'explique bien le mécanisme suivant lequel se forment toutes ces substances; comme la tyrosine perd son NH? pour donner de l'acide p-oxyphénylpropionique, le tryplophane se désamine pour donner de l'acide indolpropionique :

CCE CH COOH CCR CHE COUR | , CS QT NH? CSH: 7CH NH NH

celui-ci se simplifie et donne d’abord de l'acide indolacétique

G— CH2-- CO OH con Von NH

(9) Voir l'excellent article de Ch. Porouxr, Le tryptophane (Biologie médicale, juin-juillet 1909). Pour l'étude biochimique de l'indol consulter la Thèse de Ch. HervIRUX, Recherches biochimiques sur l'indol ( Paris-Sciences, juin. 1908).