CO | CH.OH

CH

GrimBert l'avait découvert en r901 dans les produits de fermentation du sucre par le B. fartricus (19).

Desmors se base pour le caractériser sur son pouvoir rotatoire, son pouvoir réducteur et surtout sur son osazone. Le distillat donne en effet une osazone qui fond à 243°. Comme celle du biacétyle CH*.CO.CO.CHS. et qui oxydée donne une tétrazone fusible après cristallisation dans l'alcool à 151r° (GRIMBERT) (19).

Harpex et Norris (21) ont confirmé purement et simplement les faits indiqués par Desmors.

Je les ai également souvent vérifiées et je ne donnerai que quelques détails nouveaux et quelques précisions. Le distillat que l’on obtient de ces cultures est très réducteur surtout en milieu alcalin et une réaction commode pour le constater est la réduction du bleu de méthylène en présence d’un peu de soude ou de potasse. La décoloration est presque instantanée. On avait observé ce fait depuis longtemps avec les cultures du

B. subtilis et on Pattribuait au besoin d'oxygène de cet orga-

Ge

nisme. On peut l’expliquer par la formation d’acétylméthylcarbinol.

Une dissolution de cette cétone alcoolique conservée dans un flacon mal bouché, change peu à peu d’odeur et de couleur. D’incolore elle devient peu à peu jaune verdâtre et si elle est suffisamment concentrée devient nettement verte. Son pouvoir rotatoire diminue en même temps. Une solution qui après rectification dans l’acide carbonique avait un pouvoir rotatoire de — 4°27' dans un tube de 4 dem., n'a plus au bout d'une année qu’un pouvoir rotatoire de —1"46". Distillée elle donne un liquide qui passe avant la vapeur d’eau et dont l’odeur et la couleur verte sont caractéristique de biacétyle CHS.CO.CO.CH. Il y a donc eu oxydation spontanée. Cette transformation peut être obtenue presque instantanément si l'on fait agir de l'eau de brome sur le distillat, soit au bainmarie à r100° ou mème à 30°, soit au soleil ou à la lumière électrique. C’est là une action brutale qui détruit en partie le biacétyle formé, mais qui permet facilement de caractériser l’acétylméthylcarbinol.

La production de la phénylosazone est très facile.

On obtient une osazone qui, lavée simplement à l’eau est jaune clair et fond, après dessiccation dans le vide et sur l’acide sulfurique, à 235°-240°. Elle est très peu soluble dans l’alcool, l’éther et autres solvants. Purifiée par l'alcool elle fond à 243°-24/4°. Mais cette osazone est très facilement oxydable lorsqu'elle est en solution ou imprégnée de solvants. Une solution de cette osazone dans l'éther-alcool mise dans un tube à essais, laisse tout d’abord déposer des cristaux incolores ou très légèrement jaunâtres et qui ont la forme de prismes très nets et plus ou moins allongés, assez souvent maclés. Peu à peu, la solution qui était jaune clair fonce et devient un peu rouge puis finalement rouge foncé. De nouveaux cristaux se forment alors en même temps que les prismes : ce sont de longues aiguilles feutrées, rouges. A la fin il n’y a plus de prismes et on ne recueille que des aiguilles qui sont

les cristaux de la tétrazone du biacétyle. Cette oxydation qui

PRE Die,

a été 1c1 lente est rapide au contraire si la solution présente une large surface à l'air et il faut en tenir compte quand on effectue la purification de l’osazone sans quoi on risque d’obtenir un produit dont le point de fusion sera un peu au-dessous de 243.

Traitée par l'acide chlorhydrique dilué à l’ébullition, cette phénylosazone donne à la rectification un liquide vert qui passe avant la vapeur d’eau et qui est le biacétyle.

Donc l’acétylméthylcarbinol est bien un des produits que l’on trouve dans les cultures du Z. subtilis. Sa teneur en oxygène est moindre que celle du glucose et sa formation aux dépens de cet hydrate ou carbone entraîne un quotient respiratoire supérieur à l'unité

CH#O° H O'— CHH*O? + 2CO° + 2H°0

Donc la production de ce composé cétonique doit influer

sur les échanges respiratoires provoqués par le B. subtilis.

Pour savoir en quelle mesure il faut une méthode analytitique qui permette d'obtenir des données quantitatives. C’est cette méthode que je vais maintenant exposer.

PÉRÉ qui ignorait la nature de ce corps le dosait par le pouvoir rotatoire du distillat. Il n’obtenait ainsi que des chiffres ayant une valeur relative.

Desmors pesait l'osazone. Mais dans le distillat il n'avait pas la totalité de l’acétylméthylcarbinol et de plus la préparation de l’osazone et sa purification se prêtent mal à un dosage précis.

Pour doser cette cétone alcoolique il faut :

1° Pouvoir déterminer la richesse d’une solution en ce COTPS ;

2° Pouvoir extraire des cultures la totalité de ce produit.

Je vais examiner successivement ces deux problèmes :

1° DosAGE DE L'ACÉTYLMÉTHYLCARBINOL EN SOLUTION. — Parmi

RQ

les réactions diverses que présente l’acétylméthylcarbinol, trois permettent de faire facilement des essais quantitatifs. Ce sont :

:) Le pouvoir rotaloire.

8) La production d'iodoforme.

y) Le pouvoir réducteur.

4) Pouvoir rotatoire. — Ainsi que PéRÉ l’avait déjà constaté, la déviation observée au polarimètre est proportionnelle à la concentration de la solution en produit actif. C’est là un grand avantage au point de vue analytique. Mais les déviations constatées sont faibles et, très souvent, les variations qu’il faudra suivre ne porteront que sur les minutes. Dans ces conditions la méthode polarimétrique devient peu précise.

Mais de plus, rien ne prouve qu’à côté de l’acétylméthylcarbinol gauche il n’y ait pas de l’acétylméthylcarbinol droit. Dans ces conditions le pouvoir rotatoire ne serait pas proportionnel à la quantité de cétone alcoolique contenue dans le distillat, mais proportionnel à la différence de concentration des deux isomères lévogyre et dextrogyre.

8) Production d’iodoforme. — L'acétylméthylcarbinol, à froid, est décomposé par l’iode en milieu alcalin avec une abondante production d’iodoforme que l’on peut reconnaître à son odeur et à la structure de ses cristaux. Cette réaction est rapide et peut être quantitative si l’on a soin d’opérer toujours dans des conditions rigoureusement identiques.

J’ai employé la technique suivante :

Dans un flacon de 250 cc. avec fermeture à l’émeri, je mets une quantité exactement mesurée de liquide à analyser et je complète à 20 cc. avec de l’eau distillée.

J'ajoute 10 cc. d’une solution d’iode décinormale dans de l'iodure de potassium à 10 0/0, et 15 cc. de soude normale. Le flacon, bouché, agité est mis à 30° pendant une demiheure.

J'ajoute alors 16 cc. d’acide chlorhydrique normal et je titre l'iode non transformé en iodoforme avec de l’hyposulfite décinormal. J'observe le virage avec un peu d'empois d’amidon

très léger. Par différence entre l'iode primitif et l’iode restant, je calcule l’iodoforme formé.

Cette méthode donne des résultats constants si elle est utilisée toujours dans des conditions identiques. Mais elle ne présente aucun avantage sur la méthode de dosage basée sur le pouvoir réducteur et de plus est d’un emploi plus délicat. Aussi n'y ai-je pas eu en général recours.

y) Pouvoir réducteur. — Le distillat des cultures de ces microbes en milieux sucrés est fortement réducteur : il réduit le nitrate d'argent, le bleu de méthylène, etc. Mais la réaction la plus pratique au point de vue analytique estévidemment la réduction de la liqueur de FenzinG. C’est elle que j'ai utilisé pour le dosage de l’acétylméthyicarbinol.

Cependant il faut remarquer qu'il y a dans ce distillat d’autres corps réducteurs : on y a en effet signalé la présence de l'aldéhyde formique et celle du méthylglyoxal.

Le formol n'existe pas toujours et quand il existe ce n’est qu’à l’état de traces qui ne peuvent avoir d'influence sensible sur le pouvoir réducteur.

La présence du méthylglyoxal n'est pas constante et la valeur que j'ai trouvée en général pour le point de fusion de la phénylosazone brute obtenue avec le distillat (235-240-242) montre que si cet aldéhyde cétonique existe ce n’est qu’en très faible quantité. Son osazone fond en effet à 145°.

Donc le pouvoir réducteur du distillat de ces cultures dépend presque exclusivement de sa richesse en acétylméthylcarbinol et peut par suite servir au dosage de ce corps.

Pour mesurer le pouvoir réducteur d’un liquide on peut employer deux méthodes. Dans la première on mesurelevolume de la solution nécessaire pour décolorer complètement une quantité donnée de liqueur de FenriNG. C’est la technique employée par WazpoLe (26) qui mesure la quantité de liquide nécessaire pourréduireentotalitéeten rominutes1cc.deliqueur de FenuinG. Cette méthode, rapide, très exacte dans le cas du glucose, du sucre interverti elautres sucres, n'offre ici aucune précision. En effet la liqueur de FexiNG prend une teinte ver-

Lemoigne 4

dâtre puis jaune verdâtre qui empêche d'apprécier avec netteté le moment exact où la décoloration est complète.

Dans la seconde méthode on emploie un excès de liqueur de FeuunG et l'on dose par un procédé quelconque la quantité d’oxydule de cuivre précipité:

J'ai utilisé la méthode indiquée par M. G. BERTRAND pour le dosage des sucres (27). J'ajoute à 20 cc. du distillat plus ou moins dilué, 4o ce. de liqueur de FenranG et maintiens l’ébullition pendant 3 minutes en ayant soin d'adapter au flacon un réfrigérant ascendant qui condense l'acétyIméthylcarbinol. Je filtre dans le vide, sur un filtre en amiante, redissous l'oxydule par du sulfate ferrique et dose le sulfate ferreux formé par le permanganate de potassium.

J'ai ainsi le pouvoir réducteur du distillat exprimé en centimètres cubes de permanganate ou en milligrammes de cuivre. Cette méthode est précise et donne des résultats rigoureusement constants.

J'ai d'autre part vérifié que dans les limites dans lesquelles on opère (170 milligrammes de cuivre au plus par 20 cc. de distillat), le pouvoir réducteur de ce distillat est proportionnel à sa concentration.

Pour déduire du pouvoir réducteur d’une solution sa richesse en acétylméthylcarbinol j'ai utilisé les données établies par M. KuinG (28) d’après cet auteur un gramme de cet alcool cétonique réduit à l’état d'oxydule 2 gr. 85 de cuivre. J'ai donc multiplié la quantité de cuivre réduit par le coefficient

1 ; nr ; e —& —= 0,35 pour avoir le nombre de milligrammes d'acétyl-

méthylcarbinol qui étaient contenus dans les 20 cc. analysés.

2° EXTRACTION DÉ L'ACÉTYLMÉTHYLCARBINOL.— On ne peutsonger à doser cet alcool cétonique directement dans la culture microbienne où il y a des sucres réducteurs et d’autres matières organiques capables d'agir sur la liqueur de Fenunc. I faut doncen faire l’extraction et pour cela distiller la

culture.

ET | Er

Mais il faut que cette distillation donne la totalité de ce corps et d'autre part ne le détruise pas partiellement. L’acétylméthylcarbinol bout à 141 142°, mais est entraïnable par la vapeur d’eau. J'ai étudié successivement : +) Sa distillation à la pression ordinaire ; 5) Sa distillation dans le vide.

4) DISTILLATION A LA PRESSION ATMOSPHÉRIQUE. — En fait ce que jaiétudié ce n’est pas la courbe de l’acétylméthylcarbinol pur mais celle des produits réducteurs du distillat des cultures du B. subtilis en milieux sucrés parmi lesquels, ainsi que je l'ai démontré l’acétylméthylcarbinol est de beaucoup dominant.

Je prends 300 cc. de distillat et j'en distille 250 cc. par portions de 50 cc.

Si l’on évalue le pouvoir réducteur de chaque fraction de 5o cc. par rapport au pouvoir réducteur total des 250 ce. distillés, on obtient des chiffres qui ne concordent pas exacte. ment wais donc les divergences sont néanmoins peu impor-

lantes.

I II III Ho cc. 24,29 24,70 24,3 100 — 46,7 16,8 h7,1 150 — 65,6 67,0 67,5 200 — 85,0 85,2 85,6 250 — 100,0 100,0 100,0

Mais si l’on exprime le pouvoir réducteur des diverses portions en fonction du pouvoir réducteur total des 300 ce. on obtient des résultats beaucoup moins concordants.

Une proportion assez forte des produits réducteurs reste dans les 50 cc. non distillés mais cette proportion n'est pas constante et oscille de 10 à 20 0/0.

Ces résultats indiquent

1 Que la distillation à la pression ordinaire ne permet pas

d'extraire la totalité de l'acétylméthylearbinol de La culture.

HAN INR

2° Que cette distillation provoque une altération partielle de ce composé.

Je n'ai pas précisé ce dernier point mais il faut conclure de ce fait, qu’autant que possible tout chauffage prolongé de ce corps devra être évité au cours des manipulations nécessaires

pour son extraclion

3) DiISTILLATION A PRESSION RÉDUITE. — Si l’on distille une culture de B. subtilis, en milieu sucré, dans le vide, au bainmarie à 45-50°, les premières portions du distillat sont moins concentrées en acétylméthylcarbinol que les dernières, contrairement à ce qui se produit dans la distillation à la pression atmosphérique.

Voici un exemple :

Culture de B. subtilis en milieu minéral sucré.

Pouvoir rotatoire

Volume en cc. Tube de / dem.

1° Portion du distillat . 606 2020 20 — 370 20/3"

Pour donner une idée plus précise de ce fait j'ai fait la distillation fractionnée de 300 cc. d'une solution d’acétylméthylcarbinol, par portions de 50 cc. et sous pression réduite.

La première était de 62 millimètres de mercure. Elle était maintenue constante pendant toute la durée de la distillation.

J'ai ensuite dosé l'acétylméthylcarbinol par le pouvoir réducteur des diverses fractions avec la liqueur de FenLinG

comme Je l’ai indiqué précédemment.

acétylméthylcarbinol acétylméthylcarbinol pour 400 de ce produit distillé pour 100 du produit total re portion Do ce. 17,10 12,89 20 — 100 — 90,99 26,09 3e — 100 55,08 42,54 4e — 200 — 76,60 59,14

pe — 200.— 100,00 77:02