EXPÉRIENCES FAITES AVEC LE LEVULOSÉ

Réactions des Azole RTE LE |, ue = Le Ÿ : i : | nitrique et Miçrobe . durée nitrites nitrates ammon, nitreux Organique: :

B. mesentericusvulgatüs. 37 jours faible très forte 0,0168 0,2912 0,0166 B: subtilis ” 30 — ‘très forte très forte 6,02128 0,2856 0,01720 B. mycoides.: 30 —+ très faible très forte 0,00616 0,3024 0,01572

C'est le B. mycoides en milieu glucosé qui est le dénitrifiant le plus actif puisqu'il transforme en azote ammoniacal 20,69 0/0 de l’azote nitrique alors que dans les mêmes condiz tions ie B. subtilis n’en réduit que 2,41 0/0.

Il y a peu de matière organique, mais il y en a suffisamment puisqu'il en reste dans presque tous les cas.

La conclusion de ce travail est que certains microbes du groupe du B. subtilis sont des dénitrifiants qui transforment l'azote nitrique en azote ammoniacal. Mais il y a toujours formation de nitrites et la réduction n’est jamais totale.

J'ai repris ces expériences en m'inspirant des travaux de M. Mazé sur le phénomène de la dénitrification en général.

Pour rechercher des microbes dénitrifiants, j'ai ensemencé sept bacilles du groupe du P. subtilis, isolés des lits percolateurs, dans des tubes à essais contenant 25 cc. de bouillon de haricots, addilionné de 2 0/0 de saccharose et dé 0,2 0/0 de nitrate de sodium. Les tubes étaient maintenus inclinés dans l’étuve à 30° pendant 15 jours.

Je recherchais les nitrites par le réactif de Tromsdorff et les nitrates par Île sulfate de diphénylamine. S'il y avait de l'acide nitreux, je Île détruisais par un peu d'urée en milieu acide, l'acide azotique restait seul et pouvait être caractérisé.

Les résultats furent les suivants :

B. mesen-

Microbe : B. sub- tericus Lilis ruber n0 3 n° 4 RE ENS no 6 des nitrites ) € | 2 s ] ré ) O + i ro }

Réactions

l des nitrates. ‘0 0 : re] e + + +

Trois microbes ont fait disparaître tout l'azote oxydé. Deux, les n° 4 et n° 11, ont donné des nitrites. Quant aux microbes 5 et 6, pour affirmer qu'ils ne sont pas dénitrifiants, il faudrait faire des dosages et opérer dans des conditions très variées.

J'ai surtout employé dans mes essais le 2, subtilis et le B. mesentericus ruber. J'ai résumé les principaux résultats dans une note parue en 1911 (15). 3

J'ai recherché tout d'abord si l’oxygène de l’acide nitrique ne peut pas remplacer l'oxygène de l'air.

Expérience. — Du bouillon de haricots additionné de 4 0/0 de saccharose et de 0,2 0/0 de nitrate de soude est réparti par 20 cc. dans des tubes à essais et dans des boules. Les tubes sont maintenus inclinés de manière à offrir à l’air une large surface et les boules après ensemencement sont fermées à la lampe après qu’on y a fait le vide à la trompe à eau. Je fais bouillir longtemps dans le vide le bouillon pour le bien priver d’air,

Dès le lendemain, un voile épais, plissé s’est formé dans chaque tube. Dans les boules il y a un léger développement mais presque insignifiant.

Ces cultures ont été maintenues à 30°.

Tubes inelinés ’ Boules Jours nuitrites nitrates Jours nitrites nitrates PRSUDILITS = Ta I 0 0 8 0 + B. mesentericus . I 0 0 8 0 +

Le 8e jour les boules sont ouvertes aseptiquement : l'air pénètre et le 9€ jour il n’y a plus ni nitrates ni nitrites ce qui prouve que l’ensemencement avait bien eu lieu.

Expérience. - Deux boules sont reliées l’une à l’autre par une soudure, Elle contiennent chacune en bouillon de haricots additionné de 40/0 de sucre et 0,2 0/0 de nitrate de sodium. Une des boules est ensemencée avec le B. subtilis. On fait le vide dans lappareil avec la trompe à eau et on ferme à la lampe. Dans la boule ensemencée on observe le lendemain un léger développement, Le deuxième jour je renverse un peu de son contenu dans la seconde boule, dans laquelle, le cinquième jour il n’y à pas trace de culture. L’ensemencement a eu cependant lieu puisque 24 heures après que l’on a fait rentrer l'air aseptiquement, il y a un voile fortement

plissé.

J’ai refait cette expérience avec des concentrations diverses de nitrate de Soude et j'ai toujours obtenu des résultats ana-

logues.

Donc ces microbes peuvent réduire l’acide nitrique, mais l’oxygène des nitrates est incapable de remplacer l'oxygène libre. Mais j’ai opéré en privant d’air le microbe dès le début et si la respiration intramoléculaire aux dépens du nitrate ne peut provoquer la croissance de ces organismes ne pourrait: elle pas suffire à leur entretien ? En d’autres termes, on peut se demander si une culture de ces bacilles déjà avancée dans son développement ne pourrait pas réduire l’azote nitrique en l'absence d’oxygène libre.

C’est pour résoudre cette question que j'ai fait l'essai sui-

vant:

Expérience.— Du bouillon de haricots additionné de 3 0/0 de saccharose et de 1 0/0 de nitrate de soude est réparti par 40 cc. dans un flacon d’ERLEN- Meyer de 250 cc. et dans une boule. Je fais le vide partiel dans la boule après ensemencement et la ferme à la lampe. Le microbe employé était le B. suptilis.

J'examine les cultures après 5 Jours.

Dans le flacon il y a un voile épais très plissé, il n’y a plus traces de nitrate et il n’y a pas de nitrites. La réduction a donc été complète.

Dans la boule il s’estiformé un voile mince, discontinu qui à partir du deuxième Jour ne progresse plus du tout. Malgré ce développement appréciable, malgré lexcès de matière organique, l’analyse montre qu'il y a encore beaucoup de nitrates et qu'il s’est formé des nitrites.

Donc non seulement l'oxygène libre est nécessaire pour permettre à la semence de pousser, mais il est encore indispensable à une culture ayant déjà un sensible développement.

La dénitrification ne peut donc pas être considérée dans le cas des microbes du groupe du B. subtilis comme un phénomène de résistance à l’asphyxie, puisqu'elle ne peut se produire qu'en présence de Pair.

D'autre part, les essais précédents ont montré qu’elle était rapide en présence d'oxygène libre. L'expérience suivante, choisie parmi de nombreuses autres analogues, indique qu'elle est d'autant plus intense que l’aération se fait mieux.

Expérience. — Du bouillon de haricots additionné de 3 0/0 de sucre et

de uto/o de nitrate de soude est réparti par par 4o cc. dans des tubes à essais et dans des flacons d'ERLENMELER de 250 cc.

J’ensemence soit avec du B. subtilis, soit avec du mesentericus ruber. Les tubes sont maintenus droits. Les cultures sont faites à 300. Au bout de trois jours, il n’y a plus ni azote nitrique ni azote nitreux dans les flacons. Dans les tubes la dénitrification n’est pas terminée au bout d’un mois.

Dans cet essai il n’y a pas eu formation de nitrites. Mais quelquefois, suivant la composition du bouillon, suivant la réaction primitive du milieu, des nitrites se forment et dans ces conditions la dénitrification, qui s'effectue néanmoins est beaucoup plus lente.

Si la réduction des nitrates ne se fait pas pour suppléer au manque d'oxygène libre, elle doit s'effectuer pour assurer la nutrition azotée des microbes.

Pour vérifier ce fait j'ai employé un milieu minéral dont la composition sera donnée dans la deuxième partie de cetravail et qui contient comme unique source d'azote 5 grammes de nitrate de soude par litre. Il est additionné de 4 à 3 0/0 de saccharose. Je répartis ce milieu par 50 cc. dans des flacons d'ErLENMEYER de 250 cc. La dénitrification est moins rapide qu’en présence de bouillon de haricots car le développement est plus lent. Mais par contre elle est beaucoup plus régulière. Elle est terminée en cinq jours environ et il ne se forme pas de nitrites.

L’acide azotique passe à l’état d’azote ammoniacal puis à l’état d'azote organique.

Dans le tableau suivant j'ai indiqué les résultats que j'ai obtenus dans un tel milieu minéral sucré avec le 2. subtilis. Les chiffres sont exprimés en milligrammes d'azote pour 100 cc. de culture. Au moment de l'analyse la dénitrification était complète, L’azote total est dosé par la méthode de KiezpanL. L’azote ammoniacal par distillation en présence de magnésie et l’azote organique est obtenu par différence.

Avant Après fermentation fermentation Différences ZOO IR 82,4/ 82,9/ 0:50 Azote. nitrique … | 82,44 0,00 — 82,// Azote nitreux . . . 0,00 0,00 0,00 Azote ammoniacal. .. 0,00 58,66 + 58,66

Azote organique La. 0.00 21,28 + 21,28

L'assimilation de l’azoté nitrique est ici des plus nettes : 100 0/0 de l'azote nitrique a été réduit ; 71p/0 transformé en azote ammoñiacal et 29 0/6 assimilé et transformé en azote organique. Là dénitrification a done bien été un processus de digestion.

J'ai obtenu des résultats analogues avec les nitrates dë potassium et de calcitüm.

Mais, pour que cette digestion soit possible il faut que simultanément à la réduction de l’azote nitrique se produise l'oxydation d'une matière carbonée. J'ai surtout employé le saccharose et le glucose.

Ces hydrates de carbone subissent des transformations chimiques dont l’étude fera l'objet de la seconde partie de ce travail; mais il en est une qui ne se produit pas dans la plupart des milieux non nitratés et que je signalerai ici. |

Des milieux sucrés additionnés de nitrate de soude à 0,1; 0,9 et surtout 1 0/0, puis ensemencés avec le B. subtilis, deviennent peu à peu filants et lorsque la dénitrification est terminée la viscosité des cultures est très nette.

L'alcool absolu donne un coagulum qui lavé, à l'alcool à 02 à plusieurs reprises, chauffé dans’ l'alcool bouillant à 90°, est soluble dans l’eau. Cette solution ne réduit pas la liqueur de FenciNG, mais traitée par l’acide chlorhydrique étendu, au bain-marie à r00°, elle devient réductrice et donne avec la phénylhydrazine ‘en milieu acétiqué une osazone ayant les caractères morphologiques de la glucosazone. Il ÿ a donc eu au cours de la dénitrification formation d'une substance qui semble se rapprocher des gommes.

En même temps, la réduction au nitrate provoque une alcalinisation intense de la culture : l’ammoniaque formée et la soude libérée donnent des carbonates. L'alcalinitéainsi obtenue est difficile à mesurer exactement mais néanmoins on peut dire que dans un milieu contenant 1 0/0 de nitraté de soude, le culture après dénitrification complète est aussi alcaline ou

plutôt un peu plus alcaline qu'une solution décinormale,

La formation de la gomme et l' alcalinisation Ju on vraisemblablement liées l'une à l’autre. res Je résumerai les résultats que j’ai obtenus dans l'étude de la dénitrification par certains microbes du je x” B. subtilis, dans les conclusions suivantes : | * Ces microbes ont des dénitrifiants énergiques qui transforment rapidement et complètement l'azote nitrique en azote ammoniacal et en azote organique. Les nitrites, termes intermédiaires nécessaires, n'apparaissent qu'accidentellement dans des conditions culturales défectueuses.

2° L'oxygène des nitrates est utilisé pour oxyder les matières organiques ternaires du milieu : c'est là une réaction nécessaire pour que la dénitrification au lieu. Mais c’est un moyen, ce n’est pas un but. En effet cet oxygène ne peut remplacer l'oxygène libre qui est absolument indispensable à la vie de ces microbes.

3° La réduction des nitrates est le processus de digestion de l'azote nitrique par ces bactéries. Toute condition qui favorise leur développement, favorise par cela même la dénitrification. C’est ainsi que ce phénomène est activé par une aération intense.

Ces conclusions confirment en tous points les résultats qu'avait obtenus M. Mazé avec d'autres organismes (13).

4° Ces organismes dénitrifient chaque fois qu'ils trouvent simultanément des nitrates, de la matière organique oxydable et de l'air. Or dans les lits bactériens percolateurs, où ainsi que je l'ai démontré, ces microbes sont en général dominants, ils ont à leur disposition de l'azote nitrique, de la matière organique et de l'oxygène. Il y aura donc nécessairement dénitrification.

D'autre part, la nitrification, d'après les observations récentes de MM. Muxwrz et Larné (2) et de Srevexs et WiTuers (3) peut parfaitement, dans la nature, se produire en présence de matières organiques

Donc dans les lits percolateurs où ces bactéries existeront,

les deux phénomènes inverses de nitrification et de dénitrifi-