TABLEAU XI

Influence d’un excès d'acides aminés divers sur la réaction colorée de la diiodotyrosine aux ions nitreux (Filtre S» 2 cm.).

ité ne Q ité Ne Quantité (Mg) et nature NE dre Erreur en expérience du produit ajouté retrouvée p. 100 (ug) (#&) 103 33 Mg glycocolle 103 0 103 100 Mg — 83 — 19,4 | 187 33 Mg — 184 — 1,6 187 66 Mg — 178 — 4,8 187 100 Mg — 164 — 12,2 187 100 Mg histidine 185 — 1,0 187 100 Mg phénylalanine 172 — 8,5 95 50 Mg caséine hydrolysée 96 + 1,0 | 96 100 Mg — 72 — 125; 108) 200 50 Mg — — 203 + 1,5 200 100 Mg — — 162 — 18,0 (*) Compte tenu de la tyrosine présente dans les hydrolysats de caseine.

Un excès de certains acides aminés gêne donc le dosage sans donner lieu à une réaction colorée, probablement en réagissant avec les ions nitreux par leur radical aminé, ce qui provoque la destruction d’une partie de ces ions (*). Les faits observés limitent à 50 Mg environ la quantité d'acides aminés en présence de laquelle il est possible d'opérer ; la méthode est donc directement applicable à toutes les protéines renfermant plus de 0,1 p. 100 de diiodotyrosine, c’est-à-dire aux produits thyroïdiens normaux et aux iodoprotéines artificielles. On peut néanmoins doser la diiodotyrosine dans les thyroglobulines pathologiques exceptionnellement pauvres en iode en ajoutant à leur hydrolysat une quantité connue de l'acide aminé, dont on tient compte dans le calcul des résultats. L'ensemble de

(*) Les produits de dégradation des acides aminés se formant en milieu alcalin, entre autres l’ammoniaque, les sulfures, les iodures, l’urée, ne modifient pas l'intensité de la réaction aux taux où ils sont présents dans les hydrolysats.

OR CEA

ces observations a permis d'adopter la technique suivante, laquelle comporte le dosage sur un même hydrolysat de la somme : diiodotyrosine et tyrosine (réaction aux ions nitreux) et de la tyrosine (méthode de BERNHART) (*) et le calcul, par différence, de la teneur en diiodotyrosine.

Réactifs nécessaires. — On doit disposer des réactifs destinés aux dosages de la diiodotyrosine et de la tyrosine. Les premiers sont

Solution Ï : ajouter à 10 em NaOH 10 N, 10 em° HCI 10,5 N et H:0 q.s.p. 50 cm3.

Solution IT : solution de nitrite de sodium à 1 p. 100 fraichement préparée.

NaOH 5 N NADINE CID (10 tirant JU, 5EN)E éthanol à 95° ; n-Butanol, Ammoniaque concentrée.

Les seconds sont

Solution A : dissoudre 15 g SO:Hg purifié dans 95 em SO.H: 5 N, filtrer sur verre fritté et compléter à 100 cm3 avec SO.H: 5 N.

Solution B : solution de nitrite de sodium à 1 p. 100 fraîchement preparee.

SOH: 7 N ; SO: 0,5 N.

Mode opératoire. — 100 Mg de protéine sont chauffés pendant 8 heures au bain d'huile à 115-120° en présence de 2,0 cm3 NaOH 5 N sous réfrigérant à reflux. Après refroidissement, on transvase dans un tube à centrifuger conique de 16 cm* portant un trait de jauge correspondant à un volume de 7,5 cm3. On ajoute 2 cm® NaOH 10 N et, après avoir complété à 7,5 cm? avec de l’eau distillée, on ajoute 7,5 cm* de butanol. On agite énergiquement tous les quarts d'heure pendant 2 heures, on centrifuge et l’on siphonne le butanol surnageant, lequel renferme la thyroxine. On transvase la couche aqueuse dans un ballon jaugé de 15 cm, on ajoute 3 cm° HCI concentré et l’on complète à 15 cm* avec de l’eau distillée. On prélève une partie aliquote (2 à 4 cm?) renfermant de 50 à 200 ug de diiodotyrosine, à laquelle on ajoute le nombre de cm° de solution I nécessaire pour la porter à 5 cm*, puis 2,5 cm° d’éthanol à 95° et 1 cm de solution II. On abandonne pendant 10 minutes, au cours desquelles il se développe une coloration jaune orangé. On ajoute ensuite 1,5 cm° d’ammoniaque à 20 p. 100, ce qui provoque un virage au rouge. On centrifuge et l’on détermine, dans les 15 minutes qui suivent l’alcalinisation du

(*) La méthode de BERNHART, bien que sensiblement moins précise que celle de LuGG convient pour ce dosage. Elle est très rapide, d’exécution très simple, et permet d’opérer sur des quantités minimes de produit (50 à 200 ug de tyrosine).

rat

milieu, l'intensité de l’absorption au photomètre de PULFRICH (filtre S;o cuve de 2 cm). Soit a la valeur obtenue.

La tyrosine est dosée sur une partie de l’hydrolysat renfermant de 50 à 200 ug de cet acide aminé. Pour cela, on place dans un tube à centrifuger de 10 em”, 1 ou 2 cm* de ce milieu acidifié à 0,5 N par SO,H et, si besoin est, on complète à 2 cm* par SO;H, 0,5 N. On ajoute 1,5 ml de solution A. On porte 10 minutes au bain-marie bouillant et, après refroidissement, on ajoute dans l’ordre, 1 cm? SO;H, 7 N et 1 cm* de réactif B. I1 se forme en la présence du premier un précipité dans lequel le tryptophane est entraîné à l’état de dérivé mercurique, tandis que la combinaison mereurique de la tyrosine demeure en solution et donne par la suite la réaction de MILLON. Après centrifugation, on mesure au photomètre de PULFRICH (filtre S: cuve de 2 cm) l'intensité de celle-ci dans les 15 minutes et lon repère sur la courbe d'étalonnage de la méthode de BER- NHART, établie au préalable sur des solutions titrées de tyrosine, la quantité de cet acide aminé présente dans la prise d'essai.

Connaissant la teneur en tyrosine de l’hydrolysat par unité de volume, on calcule celle accompagnant la diiodotyrosine dans l’échantillon mis en œuvre pour le dosage de celle-ci au premier temps des opérations. On détermine ensuite l’absorption dûe à cet acide aminé dans la prise d’essai en se reportant à la courbe d'étalonnage de la réaction colorée de la tyrosine en présence d'ions nitreux (fig. 4). Soit b la valeur obtenue. La quantité de diiodotyrosine est égale à la différence : a - b.

La correction ainsi introduite dans le calcul des résultats pour éliminer l’erreur par excès due à la tyrosine est de 6 à 7 p. 100 dans le cas des protéines thyroïdiennes ; elle est moindre, souvent nulle, dans celui des protéines artificiellement iodées (*). En raison de la nécessité dans laquelle on se trouve de l’appliquer aux premières, la précision de la méthode ne dépasse pas alors + 5 p. 100, tandis qu'elle atteint + 3 p. 100 quand on la met en œuvre sur les secondes.

(*) Une fraction minime de la tyrosine étant extraite par le butanol en milieu alcalin, cette correction est théoriquement un peu trop forte ; en fait, elle est si minime que l’on peut à bon droit la considérer comme correcte. L’exactitude de cette manière de voir ressort de l'observation, citée plus haut, que de la diiodotyrosine ajoutée à des hydrolysats de caséine est retrouvée quantitativement en appliquant cette correction.