TABLEAU XX

Teneur en iode pour 100 des protéines totales d'extraits thyroïdiens de divers animaux (glandes de taille normale).

Espèce animale et type d'extraction Mois de prélèvement et Iode p. 100

Rœuf (Caverr et SELHESKOG).... | novembre : 0,64 ; mars : 0.03. Bœuf (HelbeLBERGER et Pazmer). | novembre : 0,72 ; janvier : 0,45.

Cheval (Caverr et SELsEskoc).., | janvier : 0,40 ; janvier: 0,34. Chien (Caverr et SELIESKOG).... | mai-juin : 0,32. ; Porc (CAVETT et SELJESKOG)..... novembre : 0,46 ; mai : 0,08.

Porc (HeipeLBerGEr et PaLmer)., | novembre : 0,59 ; décembre : 0,47; décembre : 0,33 ; février : 0,21:

Mars 10 18 avril 02 1emarse 0,31 ; juin : 0,32; octobre : 0,39.

La solubilité en présence de sels neutres à concentration croissante des protéines que renferment ces extraits traduit leur hétérogénéité. Nous l’avons étudié sur environ cinquante préparations et l’on trouve ci-dessous (figures 8, 9, 10, 11, 12, 13) quelques exemples des résultats obtenus par les deux méthodes. ù

SRE | a- Extrait brut Cavett ST ” Herdelberger Tama 0 LC E 1 Ji ne 30 40 90 C 90 Fig. 8 — Extraits thyroïdiens bruts (Porc) préparés selon CAvETT et SELJESKOG (1 p. 100 — 0.27) et HEIDELBERGER et PALMER (I p. 100

0.25), à partir d’un même lot de glandes. Solubilité (S) en présence de mélange équimoléculaire PO;KH, + PO,K4H (C = p. 100 de solution 3.5 Midecetmélanreé) pe 6:51 00222)

La figure 8 illustre les résultats obtenus sur des extraits préparés par les techniques de CAVETT et SELJESKOG et d'HEIDEL- BERGER et PALMER sur un même lot de glandes de Porc et addi-

Dr De

tionnés de quantités progressivement croissantes de mélanges équimoléculaires de phosphates mono- et dipotassique 3,5 M, de pH — 6,5 à 22°.

Son examen rend compte que les deux types de préparations renferment en abondance un groupe de constituants protéiques dont le relargage a lieu entre les teneurs de 42 à 48 p. 100 des solutions en mélange de phosphates de potassium 3,5 M dans les conditions opératoires adoptées. Par ailleurs, le second est plus riche en fractions protéiques, les unes plus solubles et les autres moins solubles que celles-ci.

Les figures 9 à 13 établies à l’aide d’un plus grand nombre de déterminaticons, sont à cet égard plus significatives. L'hétérogénéité protéique qu'elles mettent en évidence est indépendante de l’origine animale des extraits et de la nature du sel précipitant. On le retrouve en effet lors du relargage par les phosphates alcalins, par le sulfate de sodium et par le sulfate d’ammonium (figures 9, 10). Elle se manifeste identiquement quelle que soit la richesse en iode des extraits et n’est pas modifiée par la délipidation au toluène, qui doit dès lors être considérée comme un solvant des lipides dont l'emploi ne comporte aucune dénaturation (figure 13). Les courbes de S en fonction de C sont constituées par un certain nombre de segments successifs séparés par des points particuliers correspondant au début de précipitation d’un constituant (ou groupe de constituants) plus soluble que le précédent. La position des points particuliers est pratiquement identique sur les divers graphiques dans les conditions expérimentales où nous nous sommes placés. (Il est particulièrement important de respecter la concentration des milieux en protéine, voisine de 1,2-1,4 pour 100 N protéique par cm* dans nos expériences, pour que la position de ces points conserve une signification. Une dilution des solutions protéiques provoque un léger décalage des courbes vers les concentrations plus élevées en sel). Nous avons numéroté de 1 à 5 les diverses fractions qu’ils délimitent. La première de celle-ci (1) représente les fractions de plus faible solubilité, le taux de la seconde (2) est très variable. Les trois dernières 3, 4 et 5 constituent seules, comme on le verra plus bas, la thyroglobuline, car elles renferment la quasi totalité de l’iode. L'ensemble des fractions protéiques précipitant ensuite a été désigné par «. On remarquera que leur taux respectif est variable d’une préparation à l’autre et qu’une de ces fractions peut être fusionnée avec une autre lorsque celle-ci est beaucoup

Pg9

plus abondante. Par ailleurs nous avons constaté que la conservation des extraits et leur dilution provoquent des modifications du même ordre.

Nnon protéique

0 ES à |

Fig. 9. — Extrait thyroïdien brut (Bœuf) préparé selon HEIDELBERGER et

PALMER (I p. 100 — 0.45). Solubilité (S) en présence de sulfate de sodium (C = p. 100 de solution à 25 g p. 100 ml en ce sel) pH = 6.5, DEMO

ss = (er 1 1 —.\ ss 30 40 50 60 C go Fig. 10. — Extrait thyroïdien brut (Cheval) préparé selon HEIDELBERGER

et PALMER (1 p. 100 — 0.40). Solubilité (S) en présence de mélange équimoléculaire PO;KH, + PO,K,H (C = p. 100 de solution 3.5 M de ce mélange), pH = 6:5, t — 22°.

En définitive, les fractions thyroglobulines constituent dans les extraits bruts étudiés de 60 à 80 p. 100 des protéines. Les limites de solubilité de ces produits dans une marge de concentration en divers sels neutres sont assez bien définies et

She Ÿ (142) 50 (445) S,= 1.670 mg N/cm3 Er Ninon proteique DES 40 C 50 Fig. 11. — Extrait thyroïdien brut (Porc) préparé selon HEIDELBERGER et

PALMER (1 p. 100 — 0.08). Solubilité (S) en présence de mélange équimoléculaire PO,KH + PO,K;H (CG = p. 100 de solution 3.5 M de ce mélange) pH —" 65, 10t — 22°;

ES

30 uO 50 60 C 90

Fig. 12. — Extrait thyroïdien brut (Porc) préparé selon CAVETT et SEL- JEsKÔG (I p. 100 — 0.24) ; Solubilité (S) en présence de mélange équimoléculaire PO,KH, + PO,K;H (C = p. 100 de solution 3.5 M de ce mélange), pH = 6.5, t — 22°.

ee he

constantes dans certaines conditions opératoires (42-48 p. 100 de mélange équimoléculaire des phosphates mono et dipotassique, 36 à 42 p. 100 de la saturation en sulfate d’ammonium, à pH = 6,5 et à 22°, 66 à 73 p. 100 de la teneur en solution de sulfate de sodium à 25 g. pour 100, à pH = 6,5 et à 37° dans les milieux renfermant de 1,0 à 1,5 Mg N protéique par cm). Elles sont à cet égard identiques quelle que soit leur teneur en iode et leur origine animale. Aussi, le relargage par les sels

Fig. 13. — Extrait thyroïdien brut (Porc) préparé selon HEIDELBERGER et PALMER, délipidé au toluène (1 p. 100 — 0.48). Solubilité (S) en présence de mélange équimoléculaire PO;KH, + PO,;K,:H (C = p. 100 de solution 3.5 M de ce mélange), pH = 6.5, t — 22°.

neutres n’amenant aucune dénaturation, son application à la préparation de la thyroglobuline pure trouve-t-il une première base expérimentale dans nos résultats.

C. — ELIMINATION DES IMPURETÉS PROTÉIQUES, DÉNATURATION ET PRÉPARATION DE LA THYROGLOBULINE.

HEIDELBERGER et PALMER [80] ont les premiers attiré l’attention sur l'existence dans les extraits thyroïdiens d’impuretés protéiques accompagnant la thyroglobuline et montré que la précipitation acétique de celle-ci opérée par OswaLD [145] entraîne sa dénaturation partielle. La figure 14 établie à partir des courbes de relargage par le sulfate de sodium à pH — 6,5 et à 22°, de la thyroglobuline obtenue par la méthode d’Os- WALD et de protéines totales de l'extrait thyroïdien (Porc) ayant servi de matière première à la préparation de celle-ci est

à cet égard significative. Son examen montre en effet que les protéines thyroïdiennes séparées de l'extrait par précipitation isoélectrique sont dénaturées et transformées en produits a, b et c, précipitant par le sulfate de sodium à des concentrations en celui-ci beaucoup plus faible, entre 20 et 50 p. 100 de la saturation à pH 6,5 et à 37° au lieu de 66 et 75 p. 100.

S0L b \ + Thyroglobuline Oswald 2 —- Extrait brut naturel AE 0 L “ L 7: En 10 20 30 40 50 60 70 80

Fig. 14. — A. Thyroglobuline préparée par la méthode d’Oswald (Bœuf). B. Extrait brut naturel.

Solubilité en présence de sulfate de sodium (C = p. 100 de la saturation en SONa,) pH = 6.5 et à 37°C.

HEIDELBERGER et PALMER [80] ont établi que les extraits bruts de corps thyroïde renferment un nucléoprotéide que n’élimine pas la méthode d’OswaLp, et pour HEIDELBERGER et PEDERSEN [81], la dénaturation de la thyroglobuline serait liée à sa précipitation isoélectrique (pH — 4,48), cette protéine étant très instable aux pH inférieurs à 5,0. Les premiers auteurs ont proposé de séparer le nucléoprotéide par précipitation à pH = 4,8-5,0, puis de précipiter la thyroglobuline par le sulfate de sodium à demi-saturation. Nous avons répété la préparation décrite par HEIDELBERGER et PALMER et étudié la solubilité de la protéine obtenue en présence d’un mélange phosphates mono- et dipotassique 3,5 M à concentration croissante. Les graphiques reproduits sur la figure 15 illustre les résultats obtenus. £

La fraction 1 de l'extrait brut de corps thyroïde est bien éliminée par le traitement préalable de celui-ci à pH — 4,9, mais la solubilité d’une partie de la thyroglobuline régresse

alors notablement, ce qui traduit l'apparition de constituant précipitant à des concentrations en sels inférieures à celles auxquelles commence le relargage des fractions 3, 4 et 5 des protéines totales. De plus, la fraction 2 n’est probablement pas éliminée; il se peut néanmoins que le constituant précipitant dans la même zone au cours de l’expérience soit de la thyroglobuline faiblement dénaturée. Nous avons cherché à éviter

10) Fig. 15. — Thyroglobuline de Porc préparée par la méthode d'HEIDEL- BERGER et PALMER (I p. 100 — 0.56). Solubilité (S) en présence de mé-

lange équimoléculaire de solution 3.5 M PO,KH, + PO,K:H (C = p. 100 de ce mélange), pH — 6.5, t — 22°.

cette modification de l’iodoprotéine en séparant le nucléoprotéide présent dans les extraits bruts à des pH supérieurs à 4,8- 4,9. L’acidification de solutions à pH — 5,2 provoque une précipitation des impuretés protéiques faiblement solubles sans altérer la thyroglobuline, laquelle conserve sa solubilité naturelle ; mais les produits obtenus renferment encore des quantités appréciables des fractions 1 et 2. Il en découle que le procédé d'HEIDELBERGER et PALMER doit êtré abandonné.

La méthode de CAVETT et SELJESKOG évite judicieusement toute acidification et isole la thyroglobuline en la précipitant entre 35 et 45 p. 100 de la saturation en sulfate d’ammonium. La protéine préparée selon le mode opératoire décrit par ces auteurs, en ayant soin de maintenir le pH à 6,5 pendant le re-

largage, présente des caractères de solubilité dont rend compte l'examen de la figure 16.

DS De rt 5 0 C 60 Fig. 16. — Thyroglobuline de Porc préparé par la méthode de CAveETr et

SELJESKOG (1 p. 100 — 0.30). Solubilité (S) en présence d’un mélange équimoléculaire PO,KH, + PO;,K:H (C = p. 100 de solution 3.5 M de cesmelange) pHi—06.561 022?

La thyroglobuline des auteurs américains ne renferme que des constituants protéiques de même solubilité que ceux présents dans les extraits bruts. Mais le fractionnement de ces protéines est alors très incomplet, puisque l’on y trouve en dehors de la thyroglobuline [3, 4, 5] une partie des fractions de tête (1 et 2), et, une impureté de queue, plus soluble que le constituant 5. Il n’y a pas lieu de considérer ce produit comme pur. Il a d’ailleurs été possible de le fractionner et de démontrer que seules les fractions 3, 4, 5 des extraits bruts qu’il renferme constituent la thyroglobuline. La figure 17 illustre les résultats d’une expérience que nous avons réalisée dans ce but.

Le fractionnement opéré à concentration de 44,5 p. 100 en solution 3,5 M de phosphates potassiques a permis de séparer 23,0 p. 100 de protéines précipitées (B), 77,0 p. 100 du produit (C) demeurant en solution. Les constituants les moins solubles sont ainsi concentrés dans B, riches en fractions 2 et 3, pauvres en 4 et dépourvus de 5. L’apparition de fraction 1 est sans doute due à la concentration de celle-ci, dont la préparation initiale ne renferme que 1 pour 100 environ.

Le produit C renferme, par contre, presque exclusivement

les fractions 4 et 5 de la préparation initiale, avec une trace de fraction 3. Or, la teneur en iode de B est 0,10 p. 100, celle de C de 0,34 p. 100 et celle de la préparation non fractionnée 0,305 p. 100. Si l’on rapporte la totalité de l’iode aux constituants 3, 4, 5 et si l’on calcule le degré dioduration que ceuxci présentent dans les trois produits étudiés, déterminant leur

Fig. 17. — A. Thyroglobuline de Porc préparée par la méthode de CAVETT et SELJESKÔG (1 p. 100 — 0.30). B. Même produit fractionné à une teneur de 44.5 p. 100 en mélange équimoléculaire PO,KH, + PO,K.H 3.5 M, fraction précipitée (1 p. 100 — 0.19). C. Même produit fractionné à une teneur à 44.5 p. 100 du mélange équimoléculaire PO,KH, + PO,KAH 3. M, fraction soluble (1 p. 100 — 0.34). Solubilités (S) en présence d'un mélange équimolécülaire PO;KH; + PO;KH 3.5 M (C = p. 100 de’solution.3.5 M/de ce-mélange), pH —"6.5, t%—"220;

taux respectifs, déterminés graphiquement sur les courbes cijointes, on obtient une valeur de 0,36 p. 100. Il en découle que le produit obtenu par la méthode de CAVETT et SELJESKOG renferme des fractions protéiques non iodées [1 et 2], et que la

thyroglobuline en constitue uniquement les fractions 3, 4, 5 individualisées sur les courbes de solubilité des extraits thyroiïdiens comme sur celles des préparations de CAVETT et SELJES- KOG. Le procédé de ces auteurs est donc supérieur à celui de HEIDELBERGER et PALMER en ce sens qu’il conduit à une thyroglobuline non dénaturée, mais celle-ci est souillée d’impuretés

protéiques dont ie taux est en général égal ou supérieur à 10 p. 100.