TABLEAU XXI

Précipitation des fractions iodées et phosphorées des protéines d’un extrait thyroïdien de Porc (CAVETT et SELJESKOG) par le

sulfate d’'ammonium à concentration croissante, pH — 6,5, 16020" Marge

de concentration en | P- 100 de l'azote or I Te P AE HAE de A protéique précipité des ele des nÉAtuEg dE talon a lieu | entre ces limites précipitées précipitées De 30,0 à 32,5... 1,16 traces indos. 0,395 Des? 512835; 02 2,79 traces indos.

De 35,0 à 36,0... &,19 0,13 0,482 De 35,0 à 37,0... 12,81 0,374 0,000 De 37,0 à 38,0 24,23 0,482 0,000 De 38,0 à 39,0... 22,26 0,454 0,072 De 39,0 à 40,0... 12,46 0,464 0,226 De 40,0 à 41,0... 3,26 De 41,0 à 42,0 .. 2,4% GSTOS 0:568 De 42,0 à 43,0 0195 De 43,0 à 44,0... 0,82 0,091 0,434.

De 44,0 à 45,0... 1,22 De 45,0 à 47,5... 2eUE De 47,5 à 50,0 40 2 400 0,0118 0,441

Environ 75 p. 100 des protéines iodées d’extrait thyroïdien précipitent entre 36 et 40 p. 100 de la saturation en sulfate d’ammonium à pH = 6,5 à 22°. Par contre le nucléoprotéide s’insolubilise dans les fractions de tête et les fractions de queue moins abondantes renferment du phosphore probablement lipoprotéidique. Comme la séparation d’une protéine dans un mélange comporte toujours l’entraîinement d’autres dans les zones de salinité où elle commence et où elle s’achève, on pouvait espérer obtenir la thyroglobuline pure en opérant deux fractionnements successifs entre 36 et 41 p. 100 de la saturation en sulfate d’ammonium. Le premier a été conduit sur les protéines totales des extraits d’organe, le second sur le produits de la première opération repris par une solution à 36 p. 100 de sulfate d’ammonium et centrifugé pour en éliminer les produits insolubles et les résultats obtenus -ont été mis à profit pour établir le mode opératoire permettant de préparer la thyroglobuline pure.

Préparation de la thyroglobuline pure.

1 kg de corps thyroïdes normaux de Porcs sont congelés et coupés au rasoir en tranches minces (0,8-1,5 mm), puis mis en suspension dans 3 litres de solution à 0,9 p. 100 de chlorure de sodium glacée et abandonné 24 heures à + 2° C. On filtre sur gaze. On centrifuge le filtrat pour éliminer le précipité et l’on enrichit en sel neutre par addition d’un volume convenable de solution saturée en celui-ci jusqu’à 42 p. 100 de la saturation en sulfate d’ammonium. Après 12 heures de séjour à 20° C, le précipité formé est séparé par centrifugation. On le met en suspension dans 2 litres 800 d’une solution de sulfate d'ammonium à 42 p. 100 de la saturation, puis il est ramené à 37 p. 100 de celle-ci par addition d’eau. On centrifuge 12 heures après les protéines insolubles que l’on élimine. La solution est enrichie en sel jusqu’à une teneur égale à 41 p. 100 de la saturation. Le précipité formé est mis en suspension dans du sulfate d'ammonium à 41 p. 100 de la saturation et l’on centrifuge. La solution est ainsi débarrassée successivement des fractions solubles à 41 et de celles insolubles à 37 p. 100 de la saturation en sel adsorbées au produit de la première séparation. Elle renferme la thyroglobuline pure non dénaturée. Celle-ci peut être précipitée par l’alcool ou l’acétone de ses solutions après élimination de ses sels par dialyse, si la préparation est destinée à l'analyse chimique. Les solutions dialysées peuvent être utilisées pour des recherches physicochimiques à condition d’être conservées à des pH supérieurs à 5,0-5,2, de préférence à pH —=p6,0-7,0. Fe

Le mélange équimoléculaire de phosphates mono- et dipotassique 3,5 M à pH — 6,5 peut être substitué à la solution saturée de sulfate d’ammonium dans cette série d’opérations. Il convient seulement alors de ce placer pour les fractionnements entre 43 et 48 p. 100 de la teneur en solution 3,5 M de phosphates de potassium en opérant selon des modalités identiques pour réduire au minimum les adsorptions : lavage du précipité à 48 p. 100, élimination de la solution, addition d’eau jusqu’à 43 p. 100, puis après centrifugation du précipité, traitement de la solution par 48 p. 100, isolement du précipité, remise en solution à 43 et centrifugation. L'examen de la figure 18 permet d'apprécier l'efficacité de la purification en se basant sur l’étude de la solubilité de la thyroglobuline dans un extrait brut

et après sa séparation.

Les produits obtenus dans les deux cas sont identiques au regard de leur critère de solubilité et de leur teneur en iode,

ae

lode = 0,60 p 100

lode = 0.72 p.100 | N.n prot.

mm 1 L PMSLEE à ( 30 40 CHNCG Fig. 18. — A. Extrait thyroïdien brut (Porc). B. Thyroglobuline pure préparée par notre méthode. Solubilité (S) en présence d’un mélange équimoléculaire de phosphates mono- et dipotassique (GC = p. 100 de

cetmélangsels bEMN(pPHI=EN6;5 1022000:

celle-ci étant fonction du matériel de départ. La méthode aux phosphates présente l’avantage d'éviter tout contrôle du pH et tout risque d’acidification, en raison du pouvoir tampon élevé des milieux ; mais les précipités protéiques se formant en milieu phosphate sont plus ténus que ceux prenant naissance en présence de sulfate d’ammonium et il convient de disposer

ae

pour les séparer d’une centrifugeuse assez rapide (6.000 tours par minute).

La disparition des constituants protéiques 1 et 2 et de la fraction de queue plus soluble que le constituant 5 est totale lorsque l’on passe du produit À à B. Seuls des constituants 3, 4, 5 demeurent et conservent leurs caractères de solubilité. La preuve qu’ils correspondent bien à la thyroglobuline est apportée par l'étude de la précipitation de l’azote protéique et de l’iode total des préparations purifiées, des concentrations

0 35 “wo C us Fig. 19 .— Thyroglobuline pure de Porc préparée par notre méthode (I p. 100 — 0.275). Solubilité (S) en présence de sulfate d’ammonium à concentration croissante (C — p. 100 de la saturation en ce sel),

pH —= 6.5, t — 22°. À. Variation de S en Mg d’azote protéique dissous par cm$. B. Variation de I en ug d’iode dissous par cm.

croissantes en sels neutres. La figure 19 résume les résultats d’une expérience poursuivie dans ce but en utilisant le sulfate d’ammonium comme agent de relargage.

Dans toute la marge de précipitation de la protéine, l’expérience montre donc qu’il existe une proportionalité rigoureuse entre l’insolubilisation des protéines et celle de l’iode, le rapport N/I demeurant constant dans les fractions solubles et dans les fractions précipitées aux diverses concentrations en sels. Il en découle que la composition chimique du produit séparé d’extrait thyroïdien que nous considérons comme la thyroglobuline pure est homogène. Cette conclusion est corroborée par le fait que les courbes A et A’, B et B’ présentent le même nombre de fractions caractérisées par la position des points particuliers dans A et B et par celle de leur sommet dans A’ et B’ aux mêmes concentrations en sels.

La teneur en azote de ces produits est N p. 100 — 15,8 ; ïls sont rigoureusement dépourvus de phosphore alors que ceux préparés par CAVETT, RICE et Mac CLENDON [40] en contiennent de petites quantités. Certaines de nos préparations étaient plus riches en iode que toutes celles obtenues jusqu'ici sur des organes d'animaux de même espèce, la valeur de 0,84 p. 100 I étant la plus élevée que nous ayons observée. Toutefois, la teneur en iode de ces produits est variable. La régularité des caractères de solubilité de la thyroglobuline s’oppose à la variabilité de son taux d’iode. A cet égard, l’hétérogénéité des produits purs, identique à celle de fractions correspondant à la thyroglobuline dans les extraits d'organes ne saurait être mise en doute. Etant donné que la précipitation de cette protéine s’opère dans les limites assez étroites de concentration en sels, on pouvait penser que la distinction des fractions 3, 4 et 5 était quelque peu artificielle. C’est pourquoi il a paru utile de contrôler son existence sur un critère autre que celui tiré des courbes de solubilité en fonction de la concentration en sels neutres. Nous l'avons fait en établissant le diagramme de solubilité des préparations pures à concentration constante en sel neutre et à concentration variable en protéine selon NORTHROP [144]. Les résultats obtenus en présence d’un mélange équimoléculaire PO,;KH;, + PO,K:H 1,54 M à pH = 6,5 à 24° ont été reproduits dans la figure 20.

Les deux tests auxquels nous avons fait appel pour étudier l'hétérogénéité de la thyroglobuline pure concordent donc pour démontrer l'existence dans cette protéine de 3 fractions distinctes par leur solubilité, et cela malgré l’uniformité de teneur en iode de celles-ci et la constance du rapport N/I dans l’une et l’autre, L'étude de la composition en acides aminés des

thyroglobulines préparées par la méthode ainsi décrite a permis par ailleurs de définir ces produits en se basant sur des critères chimiques. Nous en exposerons dans le prochain cha-

Le Ë È S2 ) £ LS] a 5 1 à Z ÈR ( 1 2 «) u 5 6 7 8 mg N prot total p cm de solution Fig. 20. — Solubilité de la thyroglobuline pure préparée par notre méthode (I p. 100 — 0,34) à concentration croissante en protéine dans

des milieux de teneur en phosphates mono- et dipotassique constante CAM pH "6:56 "24°

pitre les résultats et examinerons à leur propos sur quelles bases il est légitime de faire reposer la définition de la thyroglobuline pure.