TECHNIQUE HISTOLOGIQUE

Avant de commencer l'exposé de mes recherches, j'énumérerai brièvement les principales méthodes techniques que j'ai employées. Cette énumération comprendra naturellement trois parties : les fixateurs, les colorants, les imprégnations.

De Nabias recommande de prendre toujours le système nerveux d'animaux vivants. Je suis également de cet avis. Mais il propose, pour faciliter la dissection, de plonger les Pulmonés terrestres pendant 24 à 48 heures daas un vase plein d'eau! et clos. Cette pratique est fort commode, car, après ce temps, les animaux sont complètement étendus etne présentent plus qu'une très faible contractilité; de plus leurs cellules nerveuses, gonflées d’eau, résistent beaucoup mieux aux rétractions dues à certains fixateurs. Mais si ce procédé est applicable aux études d'anatomie microscopique, il ne doit jamais être employé dans les recherches cytologiques. En effet, les animaux restés dans l'eau aussi longtemps, ont subi une asphyxie et une hydratation considérables et leurs cellules nerveuses présentent diverses modifications pathologiques, dont il sera d’ailleurs parlé plus loin.

Je me suis constamment servi pour la dissection des deux procédés suivants. Quand l'animal est étendu, on sectionne rapidement d'un coup de ciseaux la partie antérieure du corps, près de la coquille, puis on incise longitudinalement le tégu-

1. Yung (1886) a montré, et j'ai pu également constater, qu'il est à peu

près indifférent d'employer de l’eau ordinaire ou de l’eau privée d'air par ébullition.

ment dorsal jusqu'au niveau des tentacules. On aperçoit alors le bulbe radulaire et, à sa partie postérieure, les ganglions cérébroïdes qui forment une masse blanchäâtre. Il suffit de récliner en haut l'œsophage pour découvrir la masse ganglionnaire sous-æsophagienne; on sectionne tous les nerfs périphériques et l’on fait glisser facilement l'anneau nerveux le long de l’æsophage. Quand l'animal est rétracté dans sa coquille, la recherche des ganglions est un peu plus délicate. On détruit d'abord l’épiphragme, puis on brise progressivement la coquille en suivant le bord supérieur des tours de spire. Quand la coquille est enlevée, on fend longitudinalement le tégument dorsal à partir du tortillon; et on arrive bientôt à un endroit où le tégument épaissi indique la fin de la région protégée par la coquille; en continuant l'incision, on voit apparaître le bulbe radulaire entouré du collier nerveux périœsophagien qu'on détache comme précédemment.

Fixateurs. — J'ai employé comme fixateurs : l'alcool à 70° et à 90°, l’acool acétique au sublimé de Gilson, le sublimé chlorurésodique, le formol à 10 p. 100, les liqueurs de Bouin, Zenker, Rabl, Tellyesnicky, Flemming, Lindsay, Laguesse.

L'alcool est un très mauvais fixateur des cellules nerveuses d'Helix et des autres Pulmonés; ces cellules étant très riches en eau sont déshydratées à un tel point qu'elles semblent déformées, ratatinées et souvent lobulées ; elles sont, de plus, dissociées, ce qui rend très difficile, sinon impossible l'étude de leurs rapports avec la névrolgie et les cellules nerveuses voisines. Je crois que c'est à l’action de l'alcool fixateur que sont dus les aspects lobulés que de Nabias a décrits comme étant provoqués par la chloroformisation.

De Nabias s'est beaucoup servi dans ses recherches de l'alcool acétique de Viallanes; je ne l'ai pas employé. Mais j'ai essayé l'alcool acétique au sublimé de Gilson. Il m'a donné des fixations imparfaites et il produit de plus un aspect réticulé du protoplasma.

De Nabias el Mac Clure ont employé le sublimé acétique; le

premier en a obtenu de bons résultats; le dernier le déclare sans

valeur à cause du ratatinement qu'il produit; je suis également de l'avis de Mac Clure, mais je ne partage pas son opinion que la solution saturée de sublimé dans l’eau salée physiologique est un bon fixateur. Je me suis servi de ce réactif, et ne l'ai guère trouvé meilleur que le sublimé acétique; mais additionné, suivant une formule d'Apathy, d’une égale quantité d'acide osmique à 4 p. 100, j'en ai constamment obtenu d'excellentes fixations.

Le formol à 10 ou à 12 p. 100, employé seul, s'est toujours montré un détestable fixateur. Je dois dire d’ailleurs que je ne m'en suis servi le plus souvent, ainsi que de l'alcool, que pour les imprégnations, suivant les méthodes qui seront décrites plus loin.

J'ai essayé le formol acétique sans beaucoup plus de succès. Le liquide de Bouin ne m'a également donné que de médiocres fixations. J'en dirai autant du liquide de Zenker et de celui de Rabi, bien que ce dernier soit recommandé par E. Holmgren pour l'étude des « Saftkanälchen » d’Helix. Le liquide de Tellyesnicky s’est également montré peu favorable pour ces fixations, bien qu'altérant moins que les précédents les éléments cellulaires. Tous ont le défaut de déshydrater plus où moins les cellules et par suite de les déformer.

Par contre, les liquides chromo-osmiques se sont constamment montrés comme les fixateurs de choix pour l'étude des cellules nerveuses d'Helix. J'ai employé avec succès les liquides de Flemming, de Lindsay Johnson et de Laguesse, que je rangerais volontiers dans cet ordre de préférences croissantes. Le seul reproche à leur adresser est de ne pas permettre toutes les colorations, et entre autres l’usage de la méthode de Nissi et

des imprégnations.

Colorants. — Je me suis servi des colorants usuels : colorants nucléaires tels que les hématoxylines, la safranine, les couleurs basiques d’aniline; colorants plasmatiques tels que les éosines, le vert lumière, l'orange, la fuchsine acide.

Les colorations combinées que j'ai le plus souvent employées ont été les suivantes : glychémalun puis éosine; hématoxyline

DE LA CELLULE NERVEUSE. #1 ferrique de Benda précédée de rouge Bordeaux ou suivie d’éosine, de fuchsine-orange ou de méthyléosine et vert lumière selon la méthode de Prenant; éosine hématoxylique de Renaut:; hématoxyline phospho-molybdique de Maïlory. La coloration à la safranine suivie de vert-lumière d’après la méthode de Benda. déjà recommandée par Mac Clure, m'a donné de très bon; résultats. Je me suis encore servi du bleu de méthylène, du bleu de toluidine et de la thionine, seuls ou suivis d’éosine. Ces dernières colorations ne réussissent pas après fixation par un liquide chromo-osmique.

Outre ces méthodes générales, j'ai encore employé diverses méthodes spéciales. Pour l'étude de la substance chromatophile des cellules nerveuses, je me suis servi de la méthode de Nissi, de celles de Lenhossék au bleu de toluidine et à la thionine, de celle de Rosin au Neutralroth. Je crois les deux méthodes de Lenhossék préférables.

Je devrais maintenant parler des méthodes de coloralion des neurofibrilles par le bleu de méthylène, mais la question n'étant pas résolue de savoir s'il s’agit là d'une teinture ou d'une imprégnalion, je les énumérerai en même temps que les méthodes d'imprégnations métalliques qui servent à étudier les mêmes neurofibrilles.

La recherche des dégénérescences n’a guère été poursuivie chez les Invertébrés. Toutes les méthodes (Weigert, Marchi, etc.) basées sur la coloration de la myéline dégénérée sont naturellement inapplicables, les nerfs des Invertébrés étant amyéliniques. Récemment, Veneziani (1906) a pu étudier la dégénérescence du nerf tentaculaire d’Helix pomaltia par la méthode de Donaggio. N'ayant pas fait de recherches sur ce sujet, je ne puis me prononcer sur la valeur de cette méthode.

J'ai cherché des colorations spécifiques de la névroglie. Les méthodes de coloration du tissu coujonctif de Curtis, Burchardt, Mallory m'ont permis de différencier le lissu conjonctif qui forme la gaine des ganglions nerveux de la substance de ces ganglions (tissus nerveux et névroglique non distincts). La méthode de Weigert pour la névroglie modifiée par Benda (hématoxyline, van Gieson); celle de Benda au Krystlallviolelt;

celle de Mallory ne m'ont pas donné de bons résultats; par contre, celle d'Anglade m'a montré avec une grande finesse la disposition des fibrilles névrogliques et leurs rapports avec les noyaux névrogliques et les cellules nerveuses; malheureusement, elle fixe mal les éléments nerveux et colore aussi le tissu

conjonctif.

Imprégnations. — J'ai employé diverses méthodes au bleu de méthylène et des imprégnations à l'argent, à l'or, à l'acide osmique, etc. ’

Retzius (1892) avait essayé la méthode d'Ehrlich sans succès; de Nabias employa la même méthode légèrement modifiée, sans obtenir de résultats très satisfaisants : certains nerfs étaient bien colorés mais les préparations étaient incertaines et les éléments nerveux altérés. Mac Clure se servit de la méthode de Dogiel et obtint avec une solution diluée de bleu de méthylène une coloration des corps cellulaires plus sombre que celle des cylindraxes. Bochenek, constala que la même méthode suivie de fixation au molybdate d’ammoniaque ne colore pas les prolongements cellulaires à cause de l'épaisseur des ganglions. J'ai essayé également la coloration au bleu de méthylène suivie ou non de fixation au molybdate sans en obtenir de résultats bien nets et constants.

La méthode de coloration des neurofibrilles au bleu de méthylène, imaginée par Bethe, a donné de mauvais résultats à Bochenek. Je n'ai pas été plus heureux que lui.

La méthode d’imprégnation par l'argent de Golgi a été essayée chezles Mollusques par Nansen sans succès, puis par Retzius qui en à obtenu de bons résultats. De Nabias, qui l'a employée, la considère comme difficile et incertaine. Havet, Veratti, Bochenek ont pu imprégner ainsi les cellules nerveuses des Pulmonés. J'ai essayé la même méthode et ses diverses modifications sans en obtenir de résultats constants et nets; le plus souvent, les préparations étaient encombrées de précipités artificiels et granuleux d'argent.

L'imprégnation des neurofibrilles d'Æelix pomatia est très difficile. Bochenek avail essayé sans résultat la méthode à

l'hématéine TA d’Apathy et je n'ai pas mieux réussi que lui. Après de longues recherches, il était parvenu à imprégner les neurofibrilles par la méthode au chlorure d’or d’'Apathy: jai répété maintes fois cette technique sans jamais observer la moindre imprégnation. De Nabias ayant publié (1904) une nouvelle méthode au chiorure d’or basée sur sa réduction par l'eau anilinée, je l'ai essayée sans succès. Je n’ai pas expérimenté la méthode de Joris à l'or colloïdal.

Parmi les méthodes à l'argent, j'en ai employé plusieurs. Celles de Ramon y Cajal ne m'ont pas montré de neurofibrilles, bien que j'aie fait amplement varier le titre des solutions de nitrate d'argent, le temps et la température de leur action sur les pièces. Cependant la solution de nitrate à 6 p. 100 appliquée pendant % jours et précédée de fixation à l'alcool ammoniacal a imprégné très nettement la névroglie. J'ai remplacé le nitrate par le lactate d'argent sans plus de succès. Les méthodes de Bielschowsky m'ont donné d’une manière inconstante des résultats satisfaisants, à la condition de remplacer la solution de nitrate à 2 p. 100 par une à 6 p. 100 et celle à 0,5 p. 100 par une autre à 1 p. 100. La méthode de Moreno (1905), basée sur l’imprégnation par le nitrate d'argent en présence de bromure de radium, employée par cet auteur pour l'étude des terminaisons nerveuses dans les ventouses des Céphalopodes, ne m'a pas donné de résultat, mais je me suis assuré que le radium ne joue aucun rôle dans ces imprégnations. Je n'ai pas essayé les méthodes de Simarro et de Lugaro.

J'ai employé sans résultat la méthode de Rossi au nitrate de platine; je ne me suis pas servi de celle de Paladino au palladium, ni de celle de Semi Meyer au bleu de Prusse.

Les méthodes de Donaggio à la pyridine ne m'ont rien montré, même la méthode IV que m'avait recommandée le professeur Donaggio.

Pour l'étude des granulations osmiophiles, j'ai utilisé les méthodes de Kopsch et de Sjôvalt à l'acide osmique, qui, si elles fixent mal les tissus et les rendent très friables, sont très constantes et électives.

La méthode de Benda au Krystallviolett, pour l'étude des

mitochondries, ne m'a pas permis d'en déceler dans les cellules nerveuses que jai étudiées.