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A) Techniques utilisant la réaction à la tyrosine :

e sont les techniques de H. Wu (4; et similaires.

Elles sont basées sur la réaction que donne l'acide phosphomolybdoungstique (réactif de Folin-Wu) avec les phénols, en particulier avec la tyrosine, l’étalon servant à la comparaison colorimétrique Stant préparé avec de la tyrosine pure. Nous les citons pour mémoire, car elles représentent un effort appréciable pour rendre le dosage des protéines plus rapide.

Sans entrer dans les détails, rappelons qu'après la séparation par le sulfate d’ammonium à demi-saturation, les précipités d’albuine et de globuline sont solubilisés puis reprécipités par l'acide ungstique pour purification, remis en solution dans le carbonate : le sodium pour préparation de la réaction colorée que l’on appréciera au photomètre. Le calcul est facile à faire: 4 Mgr de tyrosine cor- “espondant à 27, Mgr 5 d'albumine et 25, Mgr 2 de globuline.

Cette technique demeure néanmoins encore longue et les maniulations, si elles restent simples, sont encore trop nombreuses. En outre, et c’est une critique plus sérieuse, elle fait intervenir dans le calcul des coefficients que rien ne nous autorise à tenir pour absolus, pour la raison que la répartition des acides animés dans e sérum est sujette à des fluctuations qui risquent d'avoir des incilences fâcheuses sur la réaction, donc sur les résultats,

Enfin, la méthode n'a de rigueur que dans le dosage séparé des brotides et oblige le chimiste à exécuter une double série d'opérations quand celui-ci n'a en vue que le dosage global des protéines.

B) Techniques utilisant la réaction ‘du bruret :

Jes auteurs américains: Kingsley, puis Hower, Robinson et Hoglen (5) et enfin Weichselbaum (6) l’ont employée avec de petites variantes. C’est la dernière que nous retiendrons, séduits par sa simplicité. Servantie est cité comme l’ayant expérimentée en France. Nous l'avons personnellement éprouvée, suivant la description donnée par Paget (7).

Les réactifs nécessaires sont :

Réactif du biuret;

Solution urée-thymol ;

Solution de sulfate de sodium anhydre à 23 p. 100, éther, et

trois solutions-étalons de protéine préalablement titrées ;

un étalon fort, un moyen et un faible.

La technique se prête aussi bien au dosage des protéines totales u’au dosage de l’albumine seule, la différence fournissant le chiffre À globulines.

Mode opératoire :

1°) Protéines totales : dans un tube à essai, on mesure : Occ.2 de sérum, 4cc.8 de solution d’urée, 5cc. de réactif de biuret.

Après une 1/2 heure, lecture au colorimètre de Hellige: Duboscq.

2) Albumine : dans un tube à essai, on met :

Occ.ÿ de sérum,

Tcc.5 de solution de sulfate de sodium pour séparer 1

globuline, 3cc. éther.

On agite fortement le mélange — après avoir bouché le tube! avec un bouchon de caoutchouc — pendant 30 secondes. On cen-

trifuge à bonne vitesse. On a alors dans le tube 3 couches : 1" couche superficielle ayant entrainé les lipides : éther ; 2 couche : une pastille des globulines précipitées :

3° couche : un liquide limpide contenant la sérumalbumine.

On incline lentement le tube pour décoller des parois la pastill et, en évitant de la désagréger, on prélève à la pipette Bcc d solution claire. A ces 5 ce on ajoute 5 cc de réactif du biuret, etc.

Nous donnons in extenso les détails de ces opérations parce: qu'ils nous ont fourni un tournemain très commode pour la séparation facile des protéines, que nous avons adopté dans notre technique.

Une formule donne les chiffres recherchés.

Îl'est évident qu’on peut substituer au colorimètre visuel un, électro-photomètre, suivant les indications de Hogden (5) en faisant la lecture entre 560 et 700 mm. La méthode répond bien aux exigences de simplicité et de rapidité que nous nous sommes fixées. comme règle d'or dans la recherche d’une solution pratique au dosage des protéines. Mais malheureusement, la rapidité nous. semble ici obtenue aux dépens de la précision. D'une part, nous avons pu. observer que la réaction du Biuret ne donne pas des teintes constantes pour des sérums différents, surtout pour des teneurs faibles en protéines par litre. D'autre part, Servantie et nous-mêmes avons pu conclure que les variations par rapport à la méthode pondérale sont au moins de 5%, marge d'erreur déjà

importante et peu compatible avec l'exigence d'un minimum de précision.

AE Pers

3) Méthodes Chimiques.

Nous ne citerons parmi les méthodes chimiques que les méthodes très connues, qui ont d’ailleurs été utilisées par tous les auteurs pour étalonner leurs techniques et par suite à en définir le degré de précision.

Elles sont de deux ordres ;

A) Gravimétriques B) Titrimétriques

| Nous nous bornerons à en indiquer les principes. A) Gravimétrie.

| a) Protéines totales : elles sont précipitées à froid par l'alcool,

l’acétone, des mélanges acétone-alcool (qui dans le même temps délipoident le sérum), l'alcool méthylique, l'acide trichloracétique, le méthylal. Les précipités sont soigneusement désséchés puis | pesés. \

b) Dosage séparé de l’albumine et de globuline: ces fractions sont séparées par divers réactifs: Van Slyke, Cullen (8; et de nombreux auteurs emploient le sulfate d’ammoniun à demi-saturation, Kaiser (9) le sulfate de magnésium à saturation, Howe (10) le sulfate de soude anhydre à 22,2%. Les précipités sont lavés pour éliminer les réactifs, desséchés et pesés. Nous ne décrirons pas le détail des opérations qui demandent à être exécutées par un praticien averti : elles sont longues, multiples et délicates et, de ce fait, risquent d’entrainer des pertes de substance préjudiciables au résultat final. De plus elles exigent des quantités de liquide importantes allant au minimuin de 2 à 5 cc.

Ces inconvénients rendent ces techniques peu praticables, surtout dans les laboratoires cliniques.

B) Titrimétrie.

| Ces méthodes sont toutes basées sur le procédé azotométrique de Kjeldahl Les plus usitées sont celles de Howe et Piettre et Villa.

| Après ‘séparation par les réactifs usuels, les précipités sont minéralisés et on dose l’azote par la méthode de Kjeldahl (entrai- ‘nement de l’ammoniaque formée par la vapeur d’eau dans une quantité connue d’une solution titrée d'acide sulfurique et titrage par retour). Les chiffres d’azote trouvés sont convertis en protéines à l’aide de coefficients :

pour l’albumine: Piettre et Villa donnent 6,58 — 6, 62 Guillaumin 6,55.

Ep

pour la globuline: Piettre et Villa donnent 6,95, d'autres; jusqu'à 6,25. |

Ces techniques ont l'avantage sur les méthodes pondérales de: n'exiger que des prises d'essai relativement petites: Occ.ÿ et de! raccourcir la durée des opérations. Mais elles demeurent encore! longues. Elles sont tenues généralement pour précises, encore que les résultats soient régulièrement un peu élevés par rapport à la méthode gravimétrique. .

Elles appellent néanmoins un certain nombre de réserves :| D'abord, les coefficients de transformation de l'azote en protéines: n'ont pas la même valeur pour tous les auteurs: ils varient, nous l'avons vu, dans des limites assez larges. D'où résultent des écarts dans la transcription des résultats, faibles pour les chiffres d’albu-!

mine, plus importants pour les globulines, de sorte que l’établis-} sement du rapport sérine-globuline comporte une incertitude! relative. Aussi Howe préfère-t-il exprimer le résultat en azote.

En outre, la méthode est essentiellement destinée au dosage! séparé des fractions protidiques: complication superflue s’il s’agit! seulement de déterminer les protides totaux. À moins qu’à ce moment, l'on ne fasse jouer dans le calcul un coefficient moyen, encore sujet à discussion, et soumis d’autre part aux fluctuations du quotient albumineux.

Enfin, la diversité des réactifs de séparation fait que les ré-| sultats obtenus par les diverses techniques ne sont absolument plus | comparables. En effet, alors que les globulines ont été définies à | l'origine comme la fraction protidique du sérum qui précipite en totalité dans un milieu saturé au demi par le sulfate d’ammonium | à un ph défini, on a utilisé d’autres sels, notamment le sulfate et le | sulfite de sodium dont les effets sont très différents: le premier et. encore plus le second laissent en solution certaines fractions glo-. buliniques et conduisent à des taux d’albumine nettement élevés. |

Pour toutes ces raisons, la méthode de référence la plus sûre, |

parce que la plus directe demeure la méthode pondérale, qui nous | à d’ailleurs servi d’étalon.