CHAPITRE II

Méthodes néphélémétriques

Avant d'aborder l'étude des méthodes néphélémétriques, il convient de mentionner les lois qui régissent la photométrie des milieux troubles, les procédés employés (diffusimétrie etopacimétrie) et les appareils les plus usités actuellement.

. a) Loi de Rayleigh ; C'est la loi fondamentale.

Sans entrer dans Ie détail de l’équation qui l’exprime, on peut dire qu’elle définit la valeur de l'intensité du flux lumineux diffusé par des particules solides en suspension dans un milieu liquide par rapport :

— au flux lumineux incident,

— au nombre de particules non colorées,

— à la longueur d'onde de la lumière utilisée, — au volume total de matière en suspension.

Dognon (16) en a donné une analyse très claire et détaillée. cette loi implique un rapport de proportionnalité directe entre la Concentration eu particules süspendues et le flux diffusé, qui n’est valable que pour certaines dimensions des grains : de diamètre in

férieur à $— (x étant la longueur d'onde de la lumière utilisée), cessant de l'être pour les grains de dimensions superieures.

C’est ainsi que le flux lumineux absorbé croît d’abord avec la grosseur des grains, passe par un maximum puis diminue.

Conséquences pratiques : Si l'on veut donc pratiquer la néphélémétrie d'une manière valable ou autrement dit obtenir des courbes de floculation régulières, il faut :

4° s'assurer d’une taille donnée des grains dans la marge des grandeurs inférieures à la limite précédemment définie et

De di Bones

de la constance de cette taille à toutes les concentrations à mesurer.

2 que la concentration en particules suspendues ne soit pas

trop forte de manière à ce que les densités optiques restent au-dessous d’une certaine limite (90 à 100 degrés Vernes).

b) Procédés néphélémétriques :

La lecture de l'intensité d’un trouble peut se faire de deux manières :

— ou bien on estime l’affaiblissement de la lumière qui traverse le milieu: c’est l’opacimétrie,

— ou bien on estime la lumière diffusée par phénomène de Tyndall : c’est la diffusimétrie.

Ces deux procédés présentent des mérites et défauts que nous allons signaler brièvement.

a) Diffusimétrie Avantages : L'intensité de la lumière diffusée dépend essentiellement de la concentration en particules suspendues,

Pour cette raison, l'erreur demeure relativement faible même si l’on opère en milieu coloré.

Inconvénients : La lumière diffusée ne représente le plus souvent qu'une fraction très faible de la lumière incidente, d'où nécessité d’un photo-récepteur sensible. L'œil vaut mieux dans ce cas que la cellule photo-électrique.

Bb) Opacimétrie

Avantages : Le flux lumineux émergeant est important : il peut donc être mesuré avec précision par un récepteur

impersonnel (cellule photo-électrique, pile thermoélectrique.) ù

Inconvénients : L'opacimétrie est évidemment moins spécifique que la diffusimétrie car la couleur du milieu peut intervenir (Sérums très colorés).

., On peut pallier ces inconvénients par le choix d’une lumière incidente convenablement filtrée. Le filtre ne doit pas couper trop haut car l'absorption par un milieu trouble décroit quand il augmente, ni trop bas car la coloration du sérum normal fait sentir son influence, surtout au-dessous de 5.000 millimicrans. C’est pourquoi l'écran rouge (Wratten 27) à été unanimement choisi pour la pratique de l’opacimétrie avec tous les électro-photomètres. D'autre

part, pour la question qui nous occupe, la couleur du sérum n'interviendra pratiquement pas, puisque les mesures se feront sur des liquides dilués au 1/200:.

c.- Appareils utilisés.

Ils appartiennent à deux catégories :

— Appareils à observation visuelle ; — Appareils photo-électriques.

a) Appareils à observation visuelle.

1°) le colorimètre de Dubosq a été équipé d’un dispositif qui permet l’opacimétrie. On ne peut en attendre dans ce cas plus de précision que dans les mesures colorimétriques et l’on sait que celle-ci est très relative.

2°) Bien plus employés, et à juste titre, sont les photomètres du type Vernes à coin photométrique ou du type Pulfrich à diaphragme photométrique. Ce dernier permet également la diffusimétrie et l’'opacimétrie.

Nous avons pu, grâce à l’'obligeance de Monsieur le Professeur Chéchan, effectuer au Centre de recherches physico-chimiques dirigé par Monsieur le Professeur Portes, des mesures de colorimétrie et d'opacimétrie au Pulfrich avec toute la précision et la fidélité désirables. Nous nous sommes rendus compte que, malgré la lecture à l’œil nu, le coefficient personnel joue très peu.

b) Appareils photo-électriques.

1, Enopacimétrie, le colorimètre d'Evelyn est utilisable. Nous avons pu le voir fonctionner également au Centre de recherches.

Il est de construction très simple : une source lumineuse, une cuve (un tube calibré suffit), une seule cellule. On lit la division galvanométrique D et on se reporte à une courbe d'étalonnage : D=f /c/, qui n’est pas une droite.

2%, L'appareil de Meunier est construit avec deux cellules montées en opposition, avec coin photométrique. Bien qu'utilisant une méthode de zéro, il est nécessaire de faire deux lectures successives : solvant, puis solution.

3°) L'appareil de Bonnet-Maury basé sur le même principe (2 cellules en opposition, méthode de zéro) dans Rquel on substitue à l'absorption inconnue une absorption réglable de valeur connue produite par la rotation rapide d'une palette métallique de profil spécial sur le parcours du faisceau lumineux L’absorption dûe à cette palette est indépendante de sa vitesse de rotation et de la lon-

gueur d'onde ou de la polarisation de la lumière utilisée. Elle dépend seulement de sa position par rapport au faisceau lumineux intercepté.

La densité optique de ce système est définie mécaniquement et est déterminée en valeur absolue avec une très grande précision.

L'appareil est livré pour fonctionner sur le secteur-ville, muni d'une boîte d’alimention destinée à stabiliser le courant. Néanmoins nous avons constaté que ce palliatif était encore insuffisant : les variations du secteur sont certes très atténuées mais non pas supprimées. Sur la suggestion ce Monsieur le Professeur Chéchan, nous avons pris le parti d'alimenter notre appareil .avec une batterie de 6 volts qui débite évidemment un courant rigoureusement fixe. Dans ces conditions nous avonc eu toute satisfaction au point de vue de la précision et de la fidélité des mesures.

2. — Méthodes néphélémétriques appliquées au dosage des protéines

Les méthodes connues jusqu'ici méritent-elles de prendre rang parmi les méthodes valables de dosage des protéines ? C’est ce que nous allons examiner en regard de Yeurs résultats expérimentaux et à la lumière de la loi de Rayleigh.

Ces méthodes diffèrent seulement par le choix du réactif précipitant.

a) Méthode à l'acide trichloracétique :

Traditionnellement employée depuis Mestrezat pour le dosage de l’albumine du liquide céphalo-rachidien et pouvant s'appliquer à d'autres solutions protéiniques convenablement diluées sérum sanguin, liquides de ponction), elle ne présente à l'heure actuelle qu'un intérêt historique :; et ne peut prétendre qu'à donner au clinicien des indications grossières.

Laborde (12), en opérant en diffusimétrie, a pu démontrer l'excellence de l'acide trichloracétique comme réactif de précipitation quantitative des protéines, à une concentration définie /solution de densité 1,146 à 30 gr. pour 100 cc. de volume total). Nous avons Confirmé pour notre part ce point de vue, mais il ne nous a pas été donné d'obtenir des résultats d’une précision suffisante : la précipitation se fait en gros grains, s’agglomérant très rapidement en gros flacons difficiles à homogénéiser ; ce qui rend imposible toute éventualité fine du trouble, que l’on utilise des gammes étalon ou la photométrie.

bl Méthode d'Ujsagh (13) : Elle comporte deux temps : 1. — Dosage des protides totaux :

og ir

À un cc. de solution à doser, on ajoute 3 cc. du réactif suivant :

Ù Solution saturée de sulfate d'ammonium préparée à chaud et neutralisée 2 vol.

Acide chlorhydrique 0, 4 N 4 vol.

Après 15 minutes, mesure au photomètre de Pulfrich.