DOSAGE DE L’HÉMOGLOBINE

Cette méthode, qui s’applique aussi bien au sang total qu’à chacune de ses parties, plasma ou globules, fournit une première détermination approximative de leurs matériaux constitutifs principaux, savoir :

Matières albuminoïdes totales ;

Graisses, lecithines. cholestérine;

Matières organiques solubles dans l’alcool (Urée, glucose, savons, sels organiques) ;

Matières minérales solubles ;

Matières minérales insolubles.

Si ces constatations préliminaires ont été faites successivement sur les globules et sur le sérum séparés, l’on voit que si l’on a déterminé, comme on sait le faire (p. 459 et 440), les poids relatifs des globules humides et du plasma, l’on pourra rapporter à chacune de ces parties ce qui leur revient des principes ci-dessus mentionnés.

Il nous reste maintenant à dire comment on dose séparément chacun de ces principes immédiats du sang.

Dosage de Hiénsogiohine. — Deux sortes de procédés permettent de doser l’hémoglobine : (A) les procédés optiques et (B) les procédés chimiques. Les premiers peuvent être très pratiques, très expéditifs et les plus exacts.

(A) Procédés optiques. — 1° Méthode spectropliotométrique. — Cette méthode consiste a mesurer la diminution d’intensité que subit un faisceau de lumière homogène en passant à travers une solution d’hémoglobine, et à déduire de cet affaiblissement la concentration de la liqueur.

Partant de ce fait, que démontre l’expérience, que pour une même épaisseur de corps colorant l’affaiblissement relatif de l’intensité lumineuse est constante quelle que soit l’intensité initiale , il est facile

d établir la relation P — - où P, indique ce que devient l’intensité I du rayon initial à sa sortie d’une lame de matière d’épaisseur e, si pour une épaisseur = 1 l’intensité devient - (’).

Si l’on suppose l’intensité initiale I = 1 , on a P = ~ ou P = n~e. (a)

Telle est la loi de l’absorption de la lumière pour des épaisseurs variables d’une solution colorante quelconque.

Bunsen a nommé coefficient d' extinction £ d’une solution colorée l’inverse du nombre exprimant l’épaisseur sous laquelle il faut examiner celte solution pour qu’elle réduise au 10e de sa valeur primitive l’in-

(') n est donc le nombre exprimant l’inverse de l’intensité acquise après que la lumière a traversé un milieu d’épaisseur = 1. On prend généralement l’épaisseur de 10 millimètres pour unité.

MÉTHODES D'ANALYSE DU SANG

tensité du faisceau originel. Ce coefficient e se calcule par des observations pholométriques, et une fois pour toutes. Si l’on suppose, en effet,

F = ^ , l’équation (a) ci-dessus donne ne — 10; d’où, en prenant les logarithmes vulgaires : e log. n = 1, ou log. n =

Or, e — -, donc on a s — log. n.

Pour une épaisseur e quelconque on a par suite, e == — . En par-

ticulier, si l’on observe sous une épaisseur de 1 centimètre (soit e = 1), l’on aura e = — log. Prolog, p (b).

11 est facile de prouver et de comprendre que le coefficient cl' extinction d’une solution est proportionnel à sa richesse c en matière colorante.

11 en résulte que si l’on désigne par c, c', c" les concentrations

respectives d’une même substance, et par s, e', e" les coefficients d’ex-

tinction correspondants, l’on aura - =-; = — = A..

Cette quantité A, constante ainsi qu’on le voit pour chaque substance colorante, a été désignée sous le nom de rapport d'absorption. L’on

vient démontrer que l’on a : A = , et il est facile de déterminer, une

fois pour toutes A pour une concentration c égale à l’unité. Ce rapport varie un peu avec chaque sorte de lumière, et il est, suivant les cas, plus pratique de le rapporter à telle ou telle région du spectre. On le détermine en mesurant le coefficient d’extinction e d’une série de solutions de concentrations connues ( Concentration = poids de substance active par centimètre cube de liqueur). L’on a ainsi trouvé pour la lumière qui répond à la bande [3 de l’oxyhémoglobine, une valeur de A = 0,00100 pour F oxy hémoglobine de chien ; 0,001105 pour celle de rat; 0,001014 pour celle de porc; 0,0010 pour celle d’homme. Pour l 'hémoglobine réduite de chien l’on a : A= 0,001551 ; pour la carboxyhémoglobine, A = 0,001000; enfin, pour la méthémoglobine A = 0,002798.

On aura donc (d’après l’égalité A = c- J , c — As (e)>

équation qui donne la concentration c lorsqu on connaît A, et qu on a déterminé e que nous venons d’apprendre à calculer d après 1 équation [b). Comme constatation expérimentale, s ne résulte que de la détermination de l’intensité F d’une lumière d’intensité 1 après qu elle a traversé une couche de substance colorante d’épaisseur égale à 1 unité et contenant l’uni'té de poids de cette substance dissous dans l unité de volume.

SPECTROPIIOTOMÉTRIE.

Ces considérations s’appliquent à la mesure de l’intensité des substances colorées en général. S’il s’agit particulièrement du sang, la détermination de cette intensité donnera proportionnellement la quantité d’hémoglobine qu’il contient. On mesure avec les précautions que nous avons indiquées à propos de la numération des globules (p. 454), 0CC,02 de sang qui, après avoir été dilué au 200e est placé dans une cuve à faces parallèles écartées de 11 millimètres; dans la moitié inférieure de cette cuve est immergé un parallélipipède de flint de 1 centimètre d’épaisseur. Deux faisceaux de lumière provenant d’une corbeille de zircone incandescente traversent la première la partie supérieure de la cuve ayant 11 millimètres d’épaisseur, la seconde la partie inférieure ne présentant qu’une épaisseur de 1 millimètre de milieu colorant. Tout se passe donc comme si la lumière blanche traversait en haut 10 millimètres de matière colorante et arrivait en bas tout à fait inaltérée. Le double faisceau ainsi obtenu tombe alors sur la fente d’un spectroscope spécial ou spectrophotomètre.

Il s’agit de mesurer l’intensité relative des deux faisceaux; pour cela, il faut comparer non les spectres tout entiers, mais l’une de leurs parties homogènes. L’expérience a montré qu’il vaut mieux choisir la région où se forme, pour le sang oxygéné, sa deuxième bande d’absorption (a = 540 environ). Le reste du spectre est caché, dans le spectrophotomètre, par des écrans spéciaux.

L’opérateur voit donc dans la lunette deux régions lumineuses : l’une inférieure répondant à une lumière presque blanche et éclatante, l’autre supérieure éclairée par le même faisceau lumineux, mais après qu’il a traversé 10 millimètres de sang dilué, il s’agit, pour calculer c d’après l'équation ( e ) ci-dessus (c — As), de recueillir les éléments de mesure du coefficient (V absorption s en rendant l’éclat de la région lumineuse inférieure égal à celui de la supérieure.

On atteint ce but diversement dans chaque spectrophotomètre : je signalerai ici seulement ceux de Vierordt (le premier en date), de Tranniri, de Violle et de Branly, qui sont les plus précis, enfin, de Hüffner. Je ne décrirai que le dernier seulement : il donne des résultats exacts et il est facile à comprendre.

Dans l’appareil de Vierordt, l’affaiblissement de l’éclat du spectre inférieur le plus lumineux s’obtient par le rétrécissement de la partie de la fente du spectroscope qui admet le pinceau de lumière. Dans celui de Hüffner, la fente reçoit deux faisceaux contigus, dont l’un polarisé parun nicol, arrive directement à l’appareil et à l’œil, tandis que l’autre, resté à l’état de lumière naturelle traverse la couche de sang dilué. L’oculaire possède à son tour un nicol analyseur dont la rotation se mesure sur un cercle gradué. L’analyseur étant placé au 0, on interpose

METHODES D’ANALYSE DU SANG

sur le trajet du faisceau non polarisé la cuve contenant le sang ('). Le faisceau polarisé, n’ayant pas traversé le sang dilué, paraît plus brillant; l’observateur rétablit l’égalité entre les deux faisceaux supérieur et inférieur en tournant l’analyseur d’un angle a qu’on mesure sur un limbe gradué. D’après la loi connue, qui relie l’intensité 1' du faisceau polarisé à l’intensité I primitive et à l’angle a que forment les sections principales des deux niçois, l’on a I' — I CosV.. Si l’observation a lieu pour 1 centimètre d’épaisseur, comme il vient d’être dit et si l’on fait 1=1, l’on a : e = — log. Y = — • 2 log. Cos a.

Les valeurs e et A ayant été ainsi déterminées une fois pour toutes pour l’hémoglobine de diverses origines, on calcule la concentration c, plus haut détinie, par l’équation c = As que nous avons établie ci-dessus.

2° Hémochromomètre de Malassez. — Ce petit instrument a subi successivement diverses modifications. Son principe est le suivant : avec un mélange de earminate d’ammoniaque et d’acide picrique l’on peut imiter très exactement la couleur de l’hémoglobine, à ce point que les images spectrales elles-mêmes sont très analogues. Si donc on détermine une fois pour toutes la quantité d’hémoglobine qui se trouve, par centimètre cube, dans un sang dont la couleur correspond exactement pour une épaisseur donnée au type de l’étalon de picrocarminate, on pourra, en comparant les divers sangs sous des épaisseurs variables, reproduire le ton du type adopté, de telle sorte qu’à volumes égaux ces sangs contiendront une quantité d’hémoglobine inverse de l’épaisseur nécessaire pour obtenir la teinte étalon.

L’instrument se compose d’un écran rectangulaire (lig. 69) porté sur un pied et percé près de son centre de deux trous de 5 millimètres de diamètre placés côte à côte. Derrière le trou de gauche se trouve l’étalon au picrocarmin dissous dans la glycérine. Derrière celui de droite est une cuve prismatique d’épaisseur variable où l’on verse le sang d’avance dilué d’eau distillée à un titre connu (du 50e au 200e suivant les cas). Une lunette et un prisme à double réflexion totale permettent à l’observateur de comparer les deux images colorées placées côte à côte. Elles sont éclairées par un rayon de lumière réfléchie sur une plaque de faïence émaillée. Au moyen d’une crémaillère, on fait avancer ou reculer le prisme de sang jusqu’à ce que les deux images perçues par l’œil soient de même ton et de même intensité. Une échelle indique l’épaisseur du sang traversée à ce moment et une table qui tient compte (*)

(*) Dans l’appareil (|uc nous décrivons ici, celte cuve n’est pas celle dont nous parlions plus haut, qui d’ailleurs peut aussi s’employer ; dans le dispositif de Hüffner le sang dilue contenu dans une auge à faces parallèles d’une épaisseur de 10 millimètres, n est placé que devant la partie supérieure ou Inférieure de la fente du spectroscopc, celle qui ne reçoit pas le faisceau polarisé.

IIÉMOCHROMATOMÈTRE.

de l’inverse des épaisseurs et de la dilution traduit la quantité de sang en hémoglobine.

En divisant le poids de l’hémoglobine contenu au millimètre cube par le nombre des globules compris dans ce volume, on a la valeur moyenne d’un globule en hémoglobine. Un homme sain donne par millimètre cube de sang 0gr000125 d’hémoglobine et iar globule , en orenant pour unité e millionième de gramme, 0,000025.

5° Hémochromatomètre de ’layem . — Ra-

ewski , Welcker , iuinckc Gowers, layem, Henocquc,

»nt donné d’autres •rocédés pour ju- •er de la richesse Fig. Hématomètre de M. Malassez.

un sang en hémoglobine. L’appareil de Ilayem est très simple. Une ame de verre porte deux petits anneaux de verre dépoli collés à sa urface et formant cuvettes. Dans l’une, on place le sang à examiner ’ilué à un litre connu; dans l’autre, on verse de l’eau distillée et on éclaire les deux augettes par de la lumière réfléchie, partant du ûml, autant que possible. Sous l’auge qui contient l’eau distillée on fait •asser successivement des rondelles de papier teintes à l’aquarelle de ouleur sang plus ou moins foncé, et l’on s’arrête lorsque l’œil, voyant la fois sur fond blanc les deux teintes du sang et du papier coloré, âge qu il y a égalité. Si l’on a comparé ces teintes une fois pour toutes vec des sangs dont on avait, au préalable, déterminé le nombre de gloades, l’on pourra, grâce à une table spéciale, connaître celui des glo- 111 les qui répond au sang qu’on étudie, et même (grâce à un coefficient peu près invariable pour les sangs normaux) la quantité d’hémoglobine orrespondante. (Voir Ilayem, le Sang, p. 45.) Ce procédé très rapide st suffisant pour les besoins de la clinique.

MÉTHODES D’ANALYSE DU SANG

4° Ilêmaloscope d'Ilénocque. — 11 est constitué (fig. 70) par deux lames de verre rectangulaires et planes posées de façon que, se touchant par l’un de leurs côtés, elles s’écartent du côté opposé de 500 millièmes de millimètre. L’instrument se place contre une échelle graduée sur porcelaine qui porte deux divisions indiquant, celle du haut la distance des lames en millièmes de millimètre (chaque division espacée de 1 millimètre correspond à une augmentation d’épaisseur de la cuvette interlamellaire de 5 millièmes de millimètre); la seconde division, placée au-dessous, est telle que ses chiffres indiquent directement la quantité d’hémoglobine (calculée sèche) qui se trouve dans 100 centimètres cubes du sang qu’on étudie.

Pour se servir de l’instrument, on fait une piqûre au bout du doigt et l’on introduit les 4 ou 5 gouttes de sang qui s écoulent entre les lames de l’instrument, où elles pénètrent par capillarité ; il ne reste plus alors qu’à lire la division de l’échelle inférieure qui reste encore visible pour conclure la quantité d hémoglobine sèche contenue dans 100 centimètres cubes de sang. Dans le cas représente par notre ligure nous aurions 10 grammes d’hémoglobine dans 100 de sang.

L’on peut adjoindre à l’instrument un speclroscope spécial et recourir aux phénomènes des deux bandes absolument obscures. Mais, dans ce cas, l’hématoscope perd de sa simplicité et n’est plus, comme dans le cas précédent, un instrument de mesure clinique rapide et sufiisamment précis. (Voir C. Rendus. GUI. 817 et CM. 146.)

(B). Procédés chimiques. — 1° Dosage de V hémoglobine parle fer. — Une dizaine de grammes de sang sont incinérés à basse température: les cendres en sont reprises par l’acide chlorhydrique tant que celui-ci se colore, et la liqueur, réduite par le zinc, est oxydée par une solution de permanganate titrée. On obtient par le calcul le poids de fer correspondant. Ce poids multiplié par 258, donne celui de l’hémoglobine sèche correspondante O . Ce procédé est délicat, long à exécuter et peu sur.

(i) 400 d’hémoglobine contenant 0,42 de fer, 1 de fer correspond à * d’hémoglobine æ = M=238. La Quantité centésimale de fer du sang semble même s’abaisser, d’après les dernières déterminations, à 0,39, ce qui rendrait le coefficient ci-dessus égal à 263.