HISTORIQUE

L'étude de l'historique de la culture des tissus cancéreux est intéressante parce qu’elle démontre la diversité des travaux entrepris, la méthode n'étant qu’une technique, applicable dans tous les domaines. Tous les travailleurs se mettent à cultiver des tissus pour l’étude des problèmes pathologiques, et parmi ceux-ci, le cancer et les virus. Les travaux qui débulèrent alors, dans ce domaine vierge de repères, prenaient toutes les orientations et couvraient toutes les phases de la cancérologie. Chaque spécialiste dans un domaine particulier, voit les avantages que peuvent apporter à la solution de son problème des études faites sur les cellules vivantes ; plusieurs domaines ont été ainsi transformés, rajeunis par l'application de la technique : la cytologie ancienne, l’histologie, l'anatomie pathologique, la biologie chimique, la médecine expérimentale. Ce sont les spécialistes de ces sciences qui ont largement contribué aux études du cancer au moyen de la culture des tissus. Autrement dit, il n’y a pas de spécialistes de la culture des tissus, mais des biologistes, des histologistes, etc...

Sans entrer dans le détail de l’historique de la technique générale de la culture des tissus, indiquons que la technique telle qu’elle est appliquée aujourd’hui, était aussi inattendue que celle qu’emploie couramment maintenant la bactériologie. L'idée d’explantation à été conçue il y a bien longtemps, et ScauLrzE (1860) et RANvIER (1880) avaient déjà étudié la structure et les mouvements de leucocytes conservés dans des gouttes de lymphe et dans Îles caillots sanguins. Wilhelm Roux, dès 1890, étudiait le mécanisme et la cinétique de l’embryogénèse. En 1897, L. LOEB observe la croissance d’épithélium sur la surface de caillots sanguins contenus dans des

fentes où élaient placés des fragments de reins. Mais un des véritables précurseurs de la technique actuelle était JOLLY (1902-1905) qui observait in vitro la multiplication de globules rouges nucléés du sang de divers batraciens, sous des condilions physiologiques très variées. En 1907, enfin, Ross HAR- RISON démontre la génèse de la fibre nerveuse in vitro dars du lymphe coagulé. BURROWS et CARREL (1910) adoptent la méthode pour son intérêt général, appliquant (1910) à l’étude de la croissance in vitro d’un certain nombre de tissus embryonnaires, adultes et — on devait s’y attendre — cancéreux. Par l'emploi du plasma de poule (à la place de lymphe), et surtout, par la découverte des substances excito-formatrices ou tréphones, CARREL put arrêter, peu après (1912), les détails de la méthode permettant de cultiver les tissus des homéothermes in vitro à température constante.

IT était tout à fait naturel qu'après les publications de BURROWS et de CARREL, les chercheurs, dans l’impatience que leur avaient créée la stagnation et les interminables discussions des autres méthodes, adoptent celle qui permit d’accomplir des expériences libres des influences extérieures, où les seuls facteurs en expérimentation seraient localisés dans les cellules en expérience, el où les réponses des cellules pourraient être observées depuis le moment de la mise en expérience jusqu’à la fin de celle-ci. |

I fallut à peu près 3 ans à CARREL pour transformer la méthode d'une technique de simple survie à celle de croissance indéfinie. On cultive maintenant à peu près tous les tissus normaux, de tous les animaux, sous toutes les conditions, en milieux homo- el hétérogènes, avec une technique comparativement simple, ajustant par exemple les tensions de CO? et de O2, ou s’assurant de l'équilibre des sels, mais cette technique peut encore être compliquée par l’addition de vitamines où d'hormones, etc. Toutes ces modifications ne paraissent pas améliorer sensiblement la technique, qui reste simple et facile pour les tissus normaux. La technique n’a pas varié sensiblement depuis 1912. Au contraire, en ce qui concerne les tissus cancéreux, on peut dire que chaque tu-

meur cultivée a marqué une étape dans l’histoire de la culture du cancer, et il manque encore aujourd’hui des principes fondamentaux de technique.

Le début de la culture des tissus cancéreux peut être fixé à 1910, la même année, en vérité, qui a vu naître l’application de la méthode à l’étude des tissus normaux. Il est évident qu’à l’époque en question, et étant donné la nouveauté de la technique, on ne connaissait pas encore les caractères physiologiques ni même la morphologie des cellules normales in vitro ; et quand on réfléchit aux difficultés techniques qui empêchaient encore la bonne croissance des tissus normaux, on comprend combien étaient difficiles des débuts d’une méthode pareille appliquée au cancer. Les premières recherches en date (1910) sont bien celles de VOLPINO, bien qu’il soil encore question, dans ses travaux de véritable croissance. Mais les initiateurs dans ce domaine sont CARREL et BURROWS (1910). Ces deux auteurs, en même temps qu’ils poursuivaient leurs études sur les tissus normaux et le perfectionnement de la technique, mettaient en culture le sarcome de la poule de Fous, les sarcomes du rat d’'EHRLICH et de JENSEN, un carcinome du sein de chien et plusieurs tumeurs humaines : un sarcome pris au niveau du péroné el un carcinome du sein. Ils n’ont pu entretenir leurs cultures que des temps variables, de plusieurs semaines, en général, mais CARREL avait pu garder en vie quelques cultures de sarcomes jusqu’à deux mois.

LAMBERT et HANES (1911-1913), suivant ces travaux de très près, étudient les sarcomes et carcinomes de rat et de souris, ajoutant surtout un gros apport du point de vue cytologie et physiologie. CHampy el COCA (1914) étudient in vitro un adénome bénin et D. THOMSON et J. THOMSEN (1914) un papillome de l’ovaire de femme. MAccABRUNI (1914), étudie le carcinome de l'utérus humain et fait, pour la première fois in vitro une expérience de thérapeutique appliquée. LOSÉE et EBELING (1914) cultivent parfaitement le sarcome humain in vitro pendant 52 jours, comme le font aussi ALBRECHT et JOAN- NOVICZ.

Cette expérimentation n’a repris qu’en 1919, quand VE-

RATTI étudie l’adénocarcinome de chien. DREW (1922) reprend l'étude cytologique des cellules normales et cancéreuses. Enfin, FIisCHER et KiAER (1924) cultivent l’ostéosarcome et le gliosarcome humains, dont le dernier plus de deux mois.

Nous omettons de faire référence au grand nombre de tumeurs qu’on n'avait pas pu cultiver dans ces années. On ne peut pas s'empêcher, en effet, de remarquer le petit nombre de tumeurs cultivées jusqu’à ce moment, d’autant plus qu’on n'avait pas pu entretenir les cultures plus de deux mois (on cultivait déjà tous les tissus normaux et les fibroblastes cardiaques de CARREL avaient 12 ans de vie in vitro). CARREL remarque que la culture cancéreuse débute bien, mais que le caillot se liquéfie, la croissance diminue et les cellules meurent. FISCHER observe que pour certains cancers, pour lesquels les milieux de culture ressemblent de très près à ceux pour des cultures normales et qui poussaient, la croissance du début semble plus facile que celle de la culture normale, mais les cultures finissaient par mourir, comme l’avait remarqué CARREL. C’est que l’un des caractères fondamentaux des issus cancéreux poussant in vitro, comme in pivo, est la très forte fibrinolyse. Ce n’est pas cette protéolyse qui est spéciale aux cellules cancéreuses, mais plutôt sa rapidité et son intensité, car toute cellule, même normale, possède quelque capacité de protéolyse, capacité fondamentale de toute cellule vivante et active de digérer son milieu. Pour les cellules cancéreuses, des repiquages étaient nécessaires à des intervalles très rapprochées, procédé peu propice à l’obtention de bonnes cultures. Malgré cela, la fibrinolyse ne faisait qu’apparaître de plus en plus précocément, de passage en passage ; la croissance, de même, se faisait de moins en moins bien, jusqu’à la mort du fragment, dont les cellules ne trouvaient plus attache dans le milieu.

L'expérimentation systématique réduisit tout de suite et finit par éliminer cette liquéfaction, à tel point que la culture du cancer devint possible. LAMBERT et HANES préconisaient depuis 1910 l'emploi de plasma d'espèces hétérologues. Le plasma de poule, surtout, était très résistant, et se prêtait bien

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à l'emploi de milieux mixles de plasma de poule et de sérum ou de plasma homologue, dans lesquels un grand nombre de tumeurs peuvent déjà se cultiver. C’est ce qui explique le grand succès de culture du sarcome de RoOus. CARREL, dans des milieux mixtes, avait cultivé son ostéosarcome pendant deux mois, FISCHER son carcinome de souris pendant 1 mois; BISCEGLIE cultiva un adéno-carcinome de chien dans du plasma de lapin, tandis que LOSEE et EBELING avaient atteint deux mois dans des mélanges de plasmas.

FiscHER trouva un autre remède qui semblait satisfaisant, cultivant ses tumeurs dans des milieux contenant très peu d'extrait embryonnaire, ce qui ralentit considérablement la liquéfaction. CARREL, de son côté, employait des milieux artificiels, employant un peu de linoléate de soude, Tyrode, sérum el fibrinogène, ce qui paraissait produire la même action. Fis- CHER dit, à ce moment, que la valeur du procédé de la culture des tissus était dans la balance. Jusque là on n'avait pas pu démontrer si les tumeurs gardaient leur malignité in vitro, faute de technique permettant d'entretenir indéfiniment la souche. FISCHER s’est donc mis systématiquement à une étude rationnelle de la croissance cancéreuse. Il trouva, d’abord, que la fibrinolyse était ralentie par l'augmentation de l’acidité, contrairement à la théorie prévalente qui veut que la protéolyse par les tissus cancéreux, soit due à la formation d’acide lactique. FiscHER produisit l'effet désiré en ajoutant à ses milieux 25 % d’une solution isotonique de CaCl2.

Cependant ce n’est que plus tard (1924) que FISCHER réalisa la méthode qui lui permit d’entretenir en vie permanente des tissus cancéreux. À la suite de ses observations sur l’acidité, et se penchant toujours vers l'étude de la croissance dans l'organisme, FISCHER se rappela, en effet, la propriété qu'ont les cellules cancéreuses d’infiltrer les tissus normaux, remplaçant les tissus normaux de proche en proche. Il met en culture affrontée de petits fragments de tissus, du muscle pectoral inactivé par un séjour de 40 jours à la glacière, auprès des explants de sarcome de Rous. Les cellules cancéreuses, in vitro, envahissent rapidement Île muscle, qui forme

F1G. 8. — Sarcome de Rous après plusieurs passages. Le cercle de liquéfaction est grand; un tel fragment ne pourra plus se repiquer. (D’après VERNE.)

F1. 9. — Coupe d’une culture de sarcome de Rous d’après la méthode de Fischer, On dirait une coupe de muscle infiltré de l'organisme. (D’après FiscHer.) |

un réseau de soutien et sert d’aliment, et la culture obtenue de cette façon ne donne lieu à aucune liquéfaction. Ces cultures purent être entretenues el repiquées indéfiniment. Les fragments de muscles autoclavés ne se laissèrent pas infiltrer aussi bien, mais par la suite FISCHER a démontré que les cellules cancéreuses, en envahissant des fragments ou cultures normales vivantes, étouffaient la croissance des fibroblastes qui prolifèrent ; dorénavant, il n’ajoute à ses cultures que des tissus frais normaux, ou des cultures de fibroblastes, faciles à obtenir. La culture est bien celle du tissu cancéreux, comme le démontrent les contrôles faits en transplantant les cultures à des animaux neufs, et par les examens histologiques, qui montrent (fig. 9) la destruction du tissu normal et une structure polymorphe du tissu envahi, qui est aussi caractéristique que celle de la tumeur in vivo el qui fail diagnostiquer à coup sûr le cancer, ainsi enlevant toute objeclion quant à la dissemblance possible entre culture de tissus in vitro el croissance de tumeur dans l'organisme. Depuis le moment de cette découverte de FISCHER, la culture de tissus cancéreux prend un nouvel essor. De nouvelles souches sont constituées, sur lesquelles des expériences de longue haleine peuvent s’accomplir. Les premières cultures étudiées par la nouvelle technique modifiée sont encore celles de sarcome de Rous. FISCHER a entretenu sa souche pendant trois ans et demi avant de la perdre par accident, et on comprend dès lors, l'intérêt de la nouvelle technique ; surtout, les cellules normales étant maintenant bien connues, FISCHER fait paraïitre de nombreuses études et comparaisons cytologiques, physiologiques, etc...

FIscHER et ses élèves continuèrent l’application de sa nouvelle méthode, réalisant ensuite la culture des cellules carcinomateuses (1927), employant la souche de l’adéno-carcinome de souris d'EHRLICH. LASER (1927) réalisa la culture d’une autre tumeur, celle de FLEXNER-JOBLING, du rat. Dans ces deux dernières expériences, la malignité des cultures în vitro fut démontrée d’une facon absolue. Pourtant, FISCHER remarqua bientôt, que si la tumeur de FLEXNER-JOBLING ne

pouvait pas s’entretenir autrement que par cette méthode, la liquéfaction sans lissus ajoutés étant très considérable, le carcinome pouvait se cultiver assez bien dans un milieu mix'e, el après adaptation graduelle, il put entretenir ce carcinome pendant 1 an 1/2, sans ajouter de tissu. Les cellules épithéliales ainsi obtenues en culture pure, étaient malignes.

CARREL, de son côté, mit au point avec EBELING, une méthode pour la culture pure des tissus cancéreux, basée sur l'emploi de ses flacons D-5 et une nutrition sélective, en l'espèce peu d'extrait embryonnaire, comme l'avait préconisé FiscHER. Cette méthode se trouvait parfaitement appropriée à la culture pure de deux espèces de fibroblastes malins, ceux du sarcome 10 de la Fondation Crocker du rat et ceux du sarcome de JENSEN du rat.

Ainsi on voit que si les méthodes de culture pour les tissus normaux se ressemblent pour tous les tissus normaux, le problème des milieux et des techniques est, au contraire, très important pour les tissus cancéreux. La liquéfaction, la nécrose, les besoins nutritifs des cellules doivent être pris en considération dans la technique, et ceci ne sert qu’à accentuer les caractères fondamentaux des cancers. On peut énumérer maintenant des centaines de tumeurs qui ont été cultivées, jusqu'à présent, in vitro, par des méthodes calquées sur celles ci-dessus, des méthodes sélectives, mais ceci nous entraînerait {rop loin, D'ailleurs, notre but sera atteint en ne parlant que des tumeurs qui ont été l’objet de travaux démonstratifs. Il est intéressant, cependant, de signaler LEwis el STRONG (1934), qui ont cultivé 52 tumeurs spontanées du sein de la souris, se composant de 32 espèces de tumeurs différentes, el KARL HÔFER (1934), qui a étudié 60 épithéliomas humaines de la peau, baso ou spino-cellulaires, avec prises de vues cinématographiques. On étudie aussi les tumeurs mélaniques, dont l’étude est facilitée in vitro par le moindre obscurcissement du tableau dû à la présence de la mélanine (CHLOPIN, GRAND, CHAMBERS et CAMERON).