CHAPITRE II

GENERALITES

La méthode de la culture des tissus, telle qu'on la pratique aujourd’hui, ne semble guère être différente de celle des premières années el pourtant, on obtient aujourd’hui une croissance permanente des tissus in vitro où autrefois on à eu de la peine à les entretenir pendant quelques semaines. Plusieurs facteurs imperceptibles sont responsables de cette différence de résultats. En premier lieu, il y a la découverte par CARREL des substances stimulantes ou excito-formatrices, substances appelées par lui tréphones, qui paraissent indispensables à la cellule en voie de prolifération. Deuxièmement. il y a l’acquisition constante de connaissances de la morphologie, croissance et physiologie normale, sous tous les aspects, qui facilitait la compréhension des phénomènes en jeu, formant des termes de comparaison. Enfin il y a la mise au point de techniques modifiées, d’expédients anatomiques ou physiologiques, facilitant la croissance cellulaire. Pour faciliter au lecteur la compréhension de l’historique el l’évolution de la méthode de la culture des tissus, il sera utile de donner ici un apercu très bref des différentes techniques employées aujourd’hui, en présentant plus particulièrement celles qui sont utilisées dans le laboratoire du Professeur VERNE,

Idée générale

Un fragment de tissu, mesurant de 1-2 mm. de côté, fraichement prélevé et traité avec une asepsie absolue, est placé dans un coagulum filamenteux stérile et acellulaire. Cette culture, protégée contre l'infection et la dessication, montrera, à l’étuve et à uné

température optima, une émigration de cellules qui grimpent le long des filaments vers la périphérie du milieu, où elles se diviseront par mitose typique. On peut envisager plusieurs phases Eh modes dans ce phénomène. Quelques cellules peuvent quitter le fragment et s’en aller à des distances plus ou moins grandes dans le milieu, mais sans se diviser. C’est la simple survie du fragment, connue depuis longtemps, le milieu étant, pour ces cellules nonnutritif, ou le fragment étant incapable de proliférer dans ce : milieu pour des raisons spéciales. Les cellules peuvent se diviser pendant quelque temps, paraitre augmenter de nombre, mais bientôt la prolifération s’arrête. Ici encore, le milieu est non-nutritif, sans être défavorable, et les cellules ayant épuisé les substances nutritives contenues dans leur corps et le fragment, la croissance s'arrête. Cette croissance exprime l’énergie résiduelle de la culiure. Enfin, les conditions physico-chimiques du milieu et du fragment sont favorables : on trouve d’abord une phase d’émigration, débutant de quelques minutes à quelques heures après la mise en culture, suivie d’une période de vraie croissance, de multiplication el augmentation du nombre de cellules. Cette prolifération, plus ou moins intense, dure jusqu’à 48 heures, plus ou moins, puis ce phénomène s'arrête, sous l'influence de plusieurs facteurs : accumulation de déchets de métabolisme, plus ou moins toxiques, épuisement de substances nutritives ou stimulantes, surpopulation cellulaire, etc. Mais en excisant le fragment central et en le lavant soigneusement avec la solution de Ringer, par exemple, la transplantation aseptique dans un nouveau milieu nutritif permettra de voir recommencer le phénomène. Ceci peut être répété indéfiniment, représentant le type d’une culture d’un tissu.

Dans ces conditions. on voit le fragment s’arrondir, tandis qu’un voile blanchâtre s'étend dans le milieu, pouvant atteindre plusieurs fois le diamètre du fragment, constituant la colonie ou culture de cellules. Différents tissus laissent émigrer différentes sortes de celiules, et on peut parler de cultures pures ou de cultures mixtes. On peut obtenir des cultures pures soit parce que le milieu et les conditions spéciales sont d’emblée favorables, ou parce qu’on a employé quelque expédient physiologique pour les rendre ainsi ; dans d’autres conditions, les cultures mixtes donnent à plus ou moins longue échéance des cultures pures. De cette facon, nous avons beaucoup de variétés de souches pures de cellules, aussi bien que des cultures de tissus qui n’ont jamais encore été autres que mixtes. Un fragment de tissu laisse émigrer, d’après son origine, des cellules fibroblastiques, des éléments épithéliaux, des éléments sanguins (globules rouges, leucocytes), des histiocytes, etc.

On peut distinguer deux aspects architecturaux : des colonies formant tissu cohésif, telles les cultures fibroblastiques ou épithéliales

FiG. 1. — Vue à un faible grossissement de l’aspect général d’une culture pure de fibroblastes. (D’après l’auteur.)

Fic. 2. — Vue à un faible grossissement d’une culture presque pure de cellules épithéliales de rein. (D’après l’auteur.)

F1@. 3. — Vue à un fort grossissement de la disposition architecturale et cytologique de cellules fibroblastiques. (D’après l’auteur.)

Fi@. 4. — Vue à un fort grossissement de la disposition architecturale

et cytologique de cellules épithéliales. (D’après l’auteur.)

et les colonies non cohésives, où chaque cellule reste indépendante, telles les colonies de cultures de leucocytes, d’histiocytes, etc. La croissance est toujours radiaire, du fragment vers la périphérie, telle que la démontre la figure n° 1, photographie d’une culture de fibroblastes embryonnaires cardiaques de poulet, ou Ja figure n° 2, culture de cellules épithéliales de rein du rat. Les fragments sont entourés d’une auréole de cellules qui sont facilement visibles à un plus fort grossissement dans les figures 3 et 4. Les fibroblastes sont des cellules fusiformes, plus ou moins réticulées, chaque cellule étant polarisée dans la même direction (fig. 3). A l’état vivant, un espace clair marque l’emplacement du noyau ovale, plus où moins vésiculeux, à long diamètre dirigé dans la direction du rayon de la culture. La division se fait par mitose, assez fréquente et très visible (fig. 3). Ces cellules poussent dans la profondeur, à l’intérieur du coagulum, en plusieurs couches. Les cellules épithéliales, au contraire, poussent sur la surface, en couche presque unicellulaire (fig. 4). Ces cellules sont arrondies ou polygonales, quelquefois allongées, par pression réciproque, formant une membrane pavimenteuse. On peut mettre en évidence des ponts inter-cellulaires, par lesquels on a décrit le passage de granules intracellulaires. Quant aux cellules mobiles, leurs cultures montrent des cellules phagocytaires, amiboïdes qui, contrairement aux cellules fibroblastiques et épithéliales, craignent le contact. Chaque cellule est isolée et indépendante, et quand il y a surpopulation et des cellules viennent à se toucher, la mort des cellules peut s’en suivre. Dans les cultures de ces cellules, qu’elles proviennent des leucocytes du sang, des histiocytes sous-cutanées, des cellules réticulaires de la rate, etc, les cellules prennent toujours le même aspect in vitro, une grosse cellule amiboïde et phagocytaire qu’on nomme communément un macrophage.

Les solutions salines. — Les sérums

La méthode qui consiste à placer le fragment de tissu sur une lamelle de verre, recouvert d’une goutte de solution saline, n’est pas une vraie méthode de culture des tissus, la solution saline ne pouvant pas servir à la nutrition des cellules ; elle protège les cellules contre la dessication. Un certain nombre de cellules qui émigrent s’attachent au verre, s’aplatissent en couche très mince et se prêtent ainsi à l’observation très précise. La plupart des cellules se détachent, s’arrondissent et flottent dans le liquide. Les Lewis, Drew, VERNE ont fait des observations morphologiques particulière-

ment intéressantes dans des milieux salins liquides, mais la prolifération ne dure pas longtemps. Ceci correspond aussi à lexpantation ou survie simple, fertile pour l'étude de l’'embryogénèse, par exemple, où on peut maintenir en vie un organe où un embryon entier, pour en suivre l’évolution peudant un temps seulement limité. En culture de tissus, il faut s'assurer qu’on n’est pas en présence d’une simple explantation. D'ailleurs, on est vite rassuré, puisque la croissance s'arrête. Ce fait doit aussi être pris en considération dans les différentes modalités des techniques spéciales qui ont été employées.

Le sérum (sanguin, lymphe, hémolymphe, humeur aqueuse, etc.) est plus propice pour des cultures entretenues, bien qu'il ne fournisse pas le support qui paraît nécessaire pour les cellules en émisration. Cependant, certains auteurs (DES LiGxÉRIs) ont pu cultiver systématiquement dans un tel milieu.

Milieux solides.

Ce sont les vrais milieux de la culture des tissus, employant du plasma de sang coagulé par un extrait de tissus. Dans la cuiture ordinaire des tissus normaux, le plasma du sang ne sert pas à la nutrition, les cellules paraissant ne pouvoir utiliser les protéines ni du plasma ni du sérum ajouté (CARREL, CARREL et EBE- LING, FISCHER). Ce plasma fournira uniquement un réseau de fibrine transparent, le long duquel les cellules grimpent par un tropisme spécial. Sans ce réseau, dans un milieu de gélatine, par exemple, les cellules ne prennent pas leur forme caractéristique, s’arrondissent et meurent.

Les cellules prennent leur nutrition uniquement de l'extrait de tissus qui est ajouté. L’extrait employé le plus souvent est lextrait d’embryons de poulets, bien qu’on emploie assez souvent l’extrait de rate. Si la culture des tissus semble avoir adopté la poule comme animal expérimental, c’est que cet animal est le plus commode de tous les animaux expérimentaux. On obtient du sang en abondance pour la préparation du plasma (M. VERNE emploie toujours du plasma non hépariné, obtenu à l’aide de la glace, une poule fournissant en moyenne 100 cc. de sang). L’extrait embryonnaire ne peut s’obtenir plus facilement qu’en broyant des embryons de poulet (les œufs sont mis à couver au laboratoire même et les dates d’incubation notées avec soin).

M. VERNE explique que l’usage de plasma et d'extrait embryonnaire de poule est une habitude qu’on a prise arbitrairement, par la facilité que cet animal procure à la technique. Les substances contenues dans l'extrait embryonnaire ne sont point spécifiques.

Ces sub: es servent à l: its ; Re ; 1bstances servent à la nutrition des cellules, à l'excitation à

sAtres

a croissance des cellules (tréphones) et à la coagulation du plasma. L'extrait de tout tissu jeune servirait de même. Quant au plasma, non seulement la poule en donne une grande quantité, mais le caillot obtenu n’est ni trop dense ni trop liquide. Le caillot de plasma humain, par exemple, est trop dense, empêchant l’'émigration cellulaire et, de plus, se liquéfie spontanément, même pour des cellules normales. Le plasma de rat, au contraire, est assez liquide. Pour remédier à tous ces défauts, on peut employer des mélanges de plasma, cultivant des tissus de rat, par exemple, dans un mélange de plasma de poule et de rat. D'ailleurs, les tissus poussent très bien en milieux entièrement hétérologues.

Méthode de la goutte pendante

Le fragment est placé sur une lamelle dans une goutte de plasma. Après étalement du plasma sur un champ toujours le même, on coagule avec une goutte d'extrait embryonnaire de la dilution voulue. La lamelle est retournée sur une lame creuse et le tout luté soigneusement contre la dessication et l’infection. De cette facon, on peut observer la prolifération à tous les grossissements du microscope. Les cultures peuvent être facilement fixées, colorées et conservées, être soumises à la micro-dissection ou même être envoyées par la poste. Après deux jours à l’étuve, le plus souvent, la croissance s’étant ralentie, on excise le fragment central et apres lavage, on le repique dans un nouveau milieu, le processus se répétant ainsi à l'infini.

Cultures en flacons de Carrel

Dans ce procédé, on emploie de petits flacons à tubulures latérales. Cette méthode comporte deux phases, une solide, préparée de la même facon que pour la goutte pendante et contenant le fragment, l’autre liquide, constituée par une solution saline (RINGER ou TYRODE), additionnée ou non de jus embryonnaire, recouvrant la phase solide, protégeant ainsi la culture. Les quantités de chaque substance utilisée sont plus considérables, de 0,3 à 0,5 ec. Tandis que dans les cultures en goutte pendante la croissance se ralentit après 48 heures, pour les raisons déjà énumérées, les cellules se remplissant de graisse (signe de vieillesse) et exigeant un repiquage avec lavage et changement entier du milieu pour garder la souche en vie, dans les cultures en flacon de Carrel, le fragment est laissé in situ, seule la phase liquide étant renouvelée après lavage du milieu. Ces dernières cultures, de ce fait, ne subissent aucun traumatisme.

ie

Ce procédé s'emploie dans les expériences de HUE durée, la croissance continuant pendant 15-21 jours avant de s'arrêter, le repiquage étant alors exécuté de la même façon que pee goutte pendante. Aussi est-ce cette méthode qui s'emploie pour L entretien des souches normales ou cancéreuses pendant des années. L’examen microscopique, bien entendu, est plus difficile et on aura toujours recours à la méthode de la goutte pendante pour les expériences de courte durée, examens microscopiques, morphologie à l’état vivant, fixé ou coloré, microdissection, statistiques mitotiques et autres observations.

Méthode de Borrel

La méthode de Borrel favorise la prolifération des cellules sur le verre. Les cellules s’aplatissent sur le verre, y adhérant, s’étalant en très mince couche. On comprend qu’ainsi, la dimension hauteur étant pratiquement éliminée, les cellules prennent des dimensions énormes, se prêtant à des observations morphologiques très précises.

Culture dite « en vie ralentie ».

Quand on met en culture des fragments de tissu qui montrent une certaine organisation où qui élaborent dans l'organisme des produits témoignant d’une certaine spécialisation de fonction, comme pour le collagène, l’élastine ou des produits spécifiques de sécrétion, on remarque plusieurs choses. Les cellules qui émigrent des fragments ne montrent plus l’organisation caractéristique de ce tissu in vivo, les fibroblastes formant un tissu réticulaire et radiaire, l’épithélium poussant en membrane unicellulaire à la surface du caillot, etc. De plus, ces cellules semblent avoir perdu leur capacité de faire apparaitre le collagène, lélastine, substance colloïde, ete... La cellule parait prendre un aspect indifférencié, à tel point qu'on pourrait confondre des fibroblastes provenant du myocarde avec ceux dérivant de l’os, le tissu souscutané, l'aorte, etc...

Certains auteurs ont essayé, sur ces faits, d'élaborer une thé6orie de dédifférenciation, qui prétend que ces cellules ont rétrogradé, perdant leurs caractères spécifiques, pour devenir des cellules indifférenciées, à tel point que les cellules émigrant d’un fragment de rein où de glande thyroïde, par exemple, ne seraient plus des cellules épithéliales rénales ou thyroïdiennes, mais de simples cellules épithéliales indifférentes.

Mais comme l’ont démontré très conclusivement M. VERNE et son élève M. ODIETTE, et ceci d'accord avec tous les travailleurs modernes des écoles de LÉvr, OLrvo, FISCHER, LEWIs, une cellule

lt —

ne perd jamais ses propriétés spécifiques. M. VERNE explique sa théorie de la spécificité cellulaire de façon très concise dans son article intitulé : « La culture des tissus et la spécificité cellulaire ». Le théorème peut se démontrer de deux façons.

Les tréphones ou substances excito-formatrices sont les subslances qui, dans les cultures, sont responsables de la croissance active à laquelle sont stimulées les cellules normales en milieu ordinaire (WRIGHT) (plasma et extrait embryonnaire). C’est sous ces conditions d’activité et de multiplication intense que la cellule parait se dégrader, perdant l’aspect fonctionnel caractéristique pour cette cellule. FISCHER, cultivant des cellules normales dans un milieu solide contenant peu ou pas d’extrait embryonnaire, observe la réapparition de ces caractères qui dénotent la spécificité cellulaire.

Le laboratoire du Professeur VERNE emploie une autre méthode qui démontre ce phénomène d’une façon assez frappante. Généralement, on cultive les tissus à la température optima, c’est-à-dire 38 C. pour les tissus des oiseaux, 37° pour les tissus humains, etc Mais les tissus peuvent se cultiver à des températures bien plus basses, et on observe de la croissance aux températures ordinaires. Dans ces conditions, la pousse s’étend très lentement. Tous les phénomènes sont allongés et au lieu d’une vie de 15 jours à 3 semaines en flacon Carrel, la croissance se poursuit pendant 60 jours. On voit se dérouler la croissance comme au ralenti. C’est ainsi que dans notre laboratoire, ODIETTE a démontré la production de fibres élastiques dans des cultures de fibroblastes isolés de l’aorte, cultivés en culture pure depuis des mois. De même, les ostéoblastes, cellules qui ne se distinguent pas des fibroblastes du cœur dans des conditions normales, laissent voir une production d’osséine (MÉNÉGAUX et ODIETTE). Les cultures épithéliales montrent, en plus des membranes épithéliales, des évidences d'organisation, des tubules, des acini, la membrane s’épaississant, infiltrant le plasma, se kératinisant, etc... L’épithélium thyroidien recommence à produire la substance colloïde.

On peut donc dire avec M. VERXE, que les propriétés spécifiques des cellules ne sont jamais perdues, mais sont gouvernées par les conditions du milieu. Une vie très active, en présence de tréphones et à température optima, paraît faire disparaitre ces caractères spécifiques, qui sont en réalité maintenus à l’état latent. In vitro, en vie ralentie, comme dans l’organisme, les conditions physico-chimiques font que ces caractères s’extériorisent.

Evolution de la culture des tissus cancéreux.

Avec CARREL, les modalités, ou plutôt certaines modalités de la technique de la culture des tissus avaient été bien ctablies, mais

ATATRSES

il y avait encore beaucoup à apprendre concernant les conditions physico-chimiques du milieu et de la croissance des tissus in vitro, à tel point que pendant un certain temps, les difficuités ont paru insurmontables, et la méthode se voyait abandonnée de tous les côtés. Il était relativement facile d'obtenir, après un apprentissage assez long, l’asepsie absolue et l’habiieté nécessaires, mais on ne suppléait pas encore aux besoins des cellules, on n'obtenait pas une croissance régulière et permanente. Pour cette raïison, beaucoup d’expériences, dans les premiers temps, Comportaient plutôt une survie des tissus, les cultures mourant à plus ou moins longue échéance, sans que le nombre de cellules dans le milieu ait augmenté.

Quant à l'étude du cancer, qui a débuté en même temps que celle des tissus normaux, elle a été longue et devait logiquement se faire en parallèle, non seulement avec la connaissance de plus en plus approfondie des propriétés des cellules normales, mais aussi au fur et à mesure de l’expérience acquise quant aux milieux spéciaux et techniques prenant en considération les besoins particuliers des tissus et des conditions expérimentales. On ne peut pas faire mieux, pour apprécier cette évolution, que de regarder en rétrospectif la bactériologie, science moderne accomplie aux dépens de combien d’efforts patients de savants techniciens. L'étude d’une maladie d’apparence infectieuse comportait, surtout au début, l’étude des conditions de vie du microbe, lélaboration de milieux de culture plus spécialement adaptés à ce germe particulier, permettant la croissance optima, suivie enfin par l’accumulation de faits représentant le but de tant d'années de travail laborieux. Combien de faits négatifs furent rapportés quand on ignorait toute question de pH, d’anaérobisme, de besoins spéciaux en sang, sérum ou sucre ! La bactériologie est devenue une technique d’importance primordiale. De même, ce n’est que maintenant, que l’on peut apprécier l’importance capitale de la technique de la culture des tissus, qui nous démontre Pimmortalité potentielle de la cellule, la cuiture primitive de fibroblastes de myocarde de Carrel ayant été entretenue sans interruption depuis 1912 (croissant depuis 24 ans in vitro, tandis que la vie normale d’une poule ne dépasse pas dix ans, au maximum).

Si on à pu aussi facilement trouver les moyens de faire pousser in vitro les tissus normaux, il n’en a pas été de même pour les tissus cancéreux. On a vite fait d'essayer la plupart des tissus embryonnaires. Ils poussaient tous in vitro, avec le minimum de variations de milieu où de technique. Les tissus cancéreux n’obéissaient pas à cette règle et se démontraient très difficile à entretenir. Le Professeur VERNE, FISCHER, LEWIS et d’autres, ont remarqué, à ce propos, une différence très nette entre cellules cancéreuses et cellules embryonnaires. Certaines tumeurs poussent sans trop d'efforts ou

NTM Aspect typique d’une culture de tumeur (carcinome du sein) qui ne permet pas de se cultiver. Remarquer le cercle de liquéfaction et les cellules flottant dans le milieu liquide. (D’après VERNE.)

Fig. 6. — Aspect d’une culture d’adéno-carcinome de souris, montrant un foyer central de nécrose massive. (D’après FISCHER.)

avec le minimum de variations, et on peut même arriver à les faire pousser mieux que des cellules normales. Mais certaines autres tumeurs, telle un carcinome de l'utérus, que nous avons essayé dans notre laboratoire 50 fois en culture, en variant les conditions, n’ont rien donné. Il faut tout essayer pour faire pousser ces tumeurs, et dans lPétat d’ébauche où se trouve la micro-chimie cellulaire, on ne peut pas encore espérer une compréhension compiète des conditions quantitatives et qualitatives intervenant dans la croissance des tumeurs. Mais il est certain qu’il existe deux obstacles à la bonne croissance des tumeurs, la liquéfaction du milieu et la nécrose cellulaire, toutes les deux des caractères tumoraux qu’on connait depuis longtemps. Les cellules cancéreuses, en effet, provoquant la liquéfaction des protéines, ont le pouvoir de proiéolyse. Ainsi, les cultures lysent la fibrine du milieu, donnant l’aspect visible dans la figure 5, photographie d’un carcinome du sein que nous n’avons pas encore pu cultiver. L'autre obstacle est la nécrose cellulaire, bien connue in vivo. Dans les cultures de tissu cancéreux, cette mort cellulaire est parfois si intense qu'on à l'impression de regarder un cimetière cellulaire. La figure 6 montre l'aspect de cette nécrose dans une culture de carcinome.

Nous pouvons admettre, avec M. VERNE, que les cellules cancéreuses ne sont pas des cellules embryonnaires, d’après la conception de MüLzer, ni des cellules normales déplacées, d’après la conception de COHNHEIM, les cellules cancéreuses étant, de par ces caractères, des cellules modifiées, bien différentes. Pour leur étude, nous devons à la micro-chimie cellulaire le soin d'étudier ces cellules in vitro, de nous renseigner sur les moyens de surmonier ces graves empêchements à la culture permanente. D’ailleurs, micro-chimie cellulaire vivante et cytologie se groupent toutes deux, dorénavant, sous l’enseigne de la Cytologie Nouvelle.