RECHERCHES PERSONNELLES

Notre but étant de rechercher les bactériémies au cours des états de stase aiguë de l'intestin, nous avons procédé à la culture systématique du sang chez divers malades, réalisant ces conditions pathologiques.

Voici la méthode que nous avons employée :

Technique bactériologique.

Choix des milieux et des procédés de culture. — Pour la culture en &érobiose, nous avons utilisé le procédé courant culture de 10 centimètres cubes de sang dans un ballon contenant 100 centimètres cubes de bouillon de viande fraîchement préparé. Ce milieu n'est pas extrêmement nutritif, mais il a l'avantage de convenir à la culture de tous les germes aérobies une fois additionné du sang du malade. Nous avons même vu cultiver pendant vingt-quatre heures, sur ce milieu, du Bacillus perfringens, qui a d’ailleurs rapidement péri (Obs. XIÏ).

Pour la culture en anaérobiose, nous avons recherché un procédé qui nous permit de remplir la première condition dont nous parlions plus haut : l’ensemencement d’une grande quantité de sang dans une grande quantité de milieu nutritif. La culture en milieu liquide qui répond à ces desiderata nous avait d’abord séduit, et nous avions songé à réaliser le procédé si simple de Veillon : longs tubes, étroits où non, dans lesquels on répartit, sur une hauteur de 18 à 30 centimètres, du bouil-

lon ordinaire ou mieux glucosé à 1 %,, fraîchement préparé, ou régénéré par chauffage d'une denn-heure en eau bouillante. Ces tubes de « bouillon profond », simplement bouchés au coton hydrophile, permettent en ellet le développement des anaérobies.

Mais nous nous sommes heurté au grand inconvénient des milieux liquides : l'impossibilité de la séparation des germes.

Comme moyens de culture en milieu solide, nous n'avons pas songé un instant aux cultures sur gélose sous cloche pneumatique ou à la boîte de Kitasato, qui nécessitent un matériel coûteux et fragile et surtout une pompe à vide de marche parfaite, chose que le Laboratoire de médecine expérimentale ne possédait pas encore à ce moment-là, mais qu'il possède maintenant. La culture en tubes de Fraenkel, par enroulement de gélatine le long des parois, n’est pratique que si l'on possède une bonne machine pneumatique. Les tubes de Vignal, longs de 1 mètre, sont fragiles, difficiles à remplir par aspiration, il faut les casser pour repiquer les cultures. Le procédé de Veillon en gélose profonde glucosée à 2 % sur une hauteur de 10 à 15 centimètres, est évidemment le plus simple, mais ici aussi il faut casser le tube pour le repiquage:; on voit mal les cultures qui sont profondes, non étalées, etc.

Dans ces conditions, nous avons été frappé par l'élégance d'un procédé que L. Boez (de Strasbourg) à décrit à la Société de biologie, le 1% mars 1927, et c'est celui que nous avons utilisé

Le PRoOcÉDÉé be BoEz

Ses origines. — On sait, depuis Tarozzi (1905), que la eul- Lure des anaérobies peul se faire en présence de l'air si on additionne le milieu d'un fragment d’organe parenchymateux frais (rein, rate, où mieux foie). Carpano a eu l’idée de remplacer le Tragment d'organe par du sang hémolysé, qui.donne les mêmes résultats. Utilisant le procédé des boîtes de Petri renversées (procédé de Marino), il le modifie par addition de sang hémolysé et opère. ainsi

sr Re.

A 45 centimètres cubes d'agar à 2,5 % fondu et refroidi à 90° environ, on ajoute lentement ! centimètre cube à 1 ec. 5 de sérum ‘hémolysé. On ensemence et on coule dans le couvercle d'une boîte de Petri, sur lequel on renverse le fond de la boîte; on recouvre le tout d'une mince lame de verre; on peut assister au développement des colonies et les regarder par transparence au microscope, à travers les parois de la boite.

Schottmüller, lui, ensemence 10 centimètres cubes de sang du malade dans un flacon d'Erlenmeyer, contenant 100 centimètres cubes de gélose fondue, qu'il répartit en cinq à six boîtes de Petri. x

Sa technique. — De la combinaison de ces deux procédés, Boez à créé le sien, qui a les avantages des précédents sans en avoir les inconvénients

« Le dispositif proposé, écrit-1l, se compose de deux coupes

Fig. 1. — Pnspositif pour l'hémoculture en milieu anaérobie.

La gélose additionnée du sang du malade est comprise entre deux euvelles de verre, elle est constellée de colonies : «, cerelé périphérique de paraffine ; b, nervures réglant l'intervalle des cuvettes qui comprennent un volume de 130 eme. (D’après Borz).

en verre de 24. centimètres de diamètre, ayant la forme de verres d'horloge, qui s’emboîtent l’un dans l’autre en ménageant

Ü2 entre eux un espace de 130 centimètres cubes environ. L'écartement est fixé et réglé par trois cannelures repoussées dans l'assiette inférieure, qui maintiennent entre elle et son couvercle un espace de 3 millim. 1/2 au centre de l’ensemble, partie la plus spacieuse.

» Le sang du malade, recueilli dans un tube contenant L centimètre cube de solution de citrate de soude à 5 % comme anticoagulant, peut être transporté au laboratoire.

» IL est hémolysé dans 30 centimètres cubes d'eau distillée et ajouté à 100 centimètres cubes de gélose glucosée, puis introduit entre les deux verres du dispositif, où il s'étale en couche mince. L'interstice circulaire est luté avec un mélange de paraffine, 2 parties, et vaseline, 1 partie. »

Le développement des germes se fait dans le milieu qui, grâce à sa transparence, permet un repérage et une numération faciles Le centre reste rouge rubis, zone d’anaérobiose stricte. La périphérie vire au brun, zone d'hémoglobine réduite, probablement par la chaleur développée par le lutage à la paraîfine (Aubertin).

Ses avantages el ses inconvénients. — Les avantages sont nombreux et patents : grande quantité de sang et de milieu ensemencés, examen facile et numération aisée, anaérobiose parfaite permettant le développement de tous les germes anaérobies, mais aussi de beaucoup de germes aérobies qui s’accommodent volontiers de ces conditions de vie, enfin, facilité des manipulations qui peuvent être faites au laboratoire par le spécialiste, le sang étant simplement apporté en tube citraté stérile. Le sang peut même être envoyé par la poste, en tube scellé où simplement en flacon bouché de caoutchouc, puisque Boez a vu et nous-même avons constaté plusieurs fois, que le sang cultive aussi bien après vingt-quatre heures de séjour dans une pièce quelconque (ceci étant surtout vrai pour les anaérobies, ne peut s'appliquer à certains aérobies particulièrement fragiles). |

Les inconvénients existent aussi : Difficulté de décoller le couvercle de l'assiette lutée à la paraffine (on en casse quel-

cer

quefais). Dislocation du milieu quand on soulève ce couverele, d'où brouillage des points repérés pour le prélèvement, Enfin, un inconvénient qui n'est pas négligeable, c'est le prix élevé de ces assiettes (2X francs pièce), et la difficulté de s’en procurer, qui nous ont fait, au début, utiliser un succédané fabriqué par nous avec deux grands verres d'horloge de 24 centimètres et 22 centimètres de diamètre, l'un légèrement plus concave que l’autre, entre lesquels nous interposions un anneau de verre plein de 8 centimètres de diamètre, procédé qui nous a donné de bons résultats, quoique avec un peu plus de difficultés.

Moment du prélèvement. — Le plus souvent, la première hémoculture a été prélevée avant l'opération, de rares fois aussitôt après (mention en est faite dans les diverses observations). On a fait la prise de sang à la seringue dans les veines du pli du coude, après 1odisation large de la peau (20 centimètres cubes de sang en général).

La prise du liquide péritonéal à été effectuée au cours de l'opération dans de grosses pipettes fermées aussitôt après, à la lampe.

Ensemencement. — L'ensemencement du bouillon a été fait sur le champ avec les 10 premiers centimètres cubes, les 10 autres étaient vidés dans le tube contenant Fa solution de citrate de soude (1).

Les pipettes, le tube et le ballon étaient immédiatement por-

(4) Ici se place une petite modification que nous avons apportée à la méthode initiale de Boez

Pour éviter une manipulation supplémentaire inutile, cause occasionnelle de contamination, nous avons, sur les conseils du Professeur agrégé Aubertin, remplacé le tube à essais contenant { centimètre cube de solution de citrate à 5 % destiné à recevoir Le sang, par un tube un peu plus volumineux contenant à la fois le citrate de soude et l’eau distillée destinée à l’hémolyse. Ce qui aboutit en définitive à avoir un tube à essais contenant 30 centimètres cubes de solution de citrate de soude à 4 gr. 66 par litre. Le sang se conserve très bien fluide et hémolysé de cette façon, si on à soin d’agiter un peu le tube pour parfaire le mélange après le prélèvement.

és à l'éluve dans le laboratoire de l'hôpital. La culture en aérobiose à 6té laissée dans l'étuve de l'hôpital où le prélèvement avait été fait (hôpital Saint-André le plus souvent). Quelques heures après, au plus lard, nous allions chercher le tube contenant le sang citraté et les pipettes, pour les ensemencer au laboratoire de la Faculté.

Pour la culture en anaérobiose, nous avons utilisé des asstettes de Boez. stérilisées au four à flamber, une heure à 1#0°, enveloppées dans deux épaisseurs de papier buvard. Nous avons employé comme milieu, de la gélose Veillon à 2 %, glucosée à 16 %, répartie à raison de 110 centimètres cubes dans des ballons. La gélose était liquéfiée par chauffage, demiheure dans l’eau bouillante. On la laissait refroidir à 55°, on y ajoutait alors le contenu du tube de sang citraté et hémolysé, en mélangeant avec précaution, pour ne pas emprisonner de bulles d'air dans le milieu. On coulait alors le mélange entre les deux parties de l'assiette qui venait d'être dépouillée, au moment même, de sa chemise de papier. On lutait le bord en y versant directement de là parafline liquéfiée par la chaleur (1). L'assiette était portée à l'étuve à 38°.

Résultats —— Quand le résultat était négatif, on gardait la culture pendant dix jours à l'étuve en observation pour ne pas laisser passer inaperçu le développement tardif d'un streptocoque anaérobie (CF. Bull. et Mém. Soc. chir., avril 1928). Nous ne l'avons d'ailleurs jamais observé.

Quand le résultat était positif, les colonies apparaissaient vénéralement dès la seizième heure, sous forme de petites taches d'hémolyse où de fines bulles ou encore de points brunâtres, souvent frès abondants el « constellant » véritablement le milieu (hémocullure chez le chien), parfois au contraire discrets (hémocullure chez l'homme).

Au bout de vingt-quatre heures d'étuve, le milieu était pro-

(D) Celle-ci était répartie dans des flacons poudriers de 60 centimètres cubes pleins aux {rois-quarts, bouchés de coton et stérilisés à l’autoclave demi-heure à 1209, Elle était liquéfiée dans le même bain-marie que le ballon de gélose Veillon. É

No —

fondément modifié dans les cas nettement positifs. La couleur rouge cerise de l'hémoglobine était remplacée par une teinte brun noirâtre. De larges bulles aux contours dentelés et irréguliers découpaient la surface et se mobilisaient quand on déplaçait l'assiette avec une petite quantité de liquide brun audessous du couvercle qui n’adhérait plus à la gélose.

Enfin, parfois même (hémoculture positive au Perfringens), le milieu était complètement disloqué par de larges crevasses et la force des gaz était telle que le couvercle était soulevé par eux et le lutage à la paraffine distendu, puis crevé pour leur donner issue.

Repiquage. — Après décollement du couvercle de la boîte avec une lame rougie au feu, les repiquages étaient faits par le Professeur agrégé Aubertin, sur différents milieux (bouillon, milieux à l'œuf, au sulfure d'antimoine, etc., privés d’air par la machine pneumatique) pour identifier les souches.

Observations personnelles de péritonites aiguës et perforations d'organes.