CHAPITRE II

Procédés et cultures employés par les différents auteurs

Nous allons citer les passages relatifs à notre sujet relevés dans les diverses observations parues jusqu’à ce jour et nous pourrons voir que les auteurs (à part quelques rares exceptions qui ont abouti d’ailleurs à un résultat négatif) ont choisi les veines du pli du coude, et non pas les veinules des extrémités, pour faire le prélèvement du sang à examiner. Les uns, au début, n’ont pris que quelques gouttes, craignant qu'une trop grande quantité de sang ne nuisit, par son pouvoir bactéricide, au développement du gonocoque. Puis les auteurs suivirent l'exemple de Prochaska, Unger et Diggelman, et prélevèrent une assez grande quantité de sang, 10 à 20 centimètres cubes environ, qu'ils ensemencèrent largement.

Pour les cultures (les milieux habituels étant abandonnés comme impropres), ce sont les milieux solides qui ont été le plus souvent employés. Parmi ceux-ci, nous devons signaler plus particulièrement la gélose mélangée avec le liquide d’ascite ou avec du sang, puis la gélose-hydrocèle et la gélose-urine.

Dans les milieux liquides, nous trouvons le bouillon uni en des proportions différentes avec le liquide d’ascite et d’hydrocèle.

Des auteurs, comme Prochaska, Unger et Diggelman, ensemencent le sang dans un ballon contenant une grande quantité de bouillon, attendant plusieurs jours qu’une pellicule se forme sur la surface du bouillon. Si cette pellicule, examinée au microscope, contient des gonocoques, ils la réensemencent sur

gélose-ascite ou sang gélosé pour obtenir des colonies de gonocoques.

Faure-Beaulieu, craignant que ce bouillon laissé si longtemps ensemencé ne soit souillé par des microbes étrangers, qui risquent d’étouffer le gonocoque, ne le laisse que vingt-quatre heures et le réensemence sur gélose-ascite sans attendre la formation de la pellicule.

Il est intéressant de noter que Oro (1992), qui a essayé en vain de déceler la présence du gonocoque dans le sang de 50 blennorragiques sans complications, s’est servi comme milieu de culture de la gélose au sang humain et glycérinée.

Ogservarion I (Hewes, 1894) Rhumatisme blennorragique avec fièvre

M. D... entre salle 31 du Massachusets General Hospital, le 14 mars.

Le 17, le sang est ensemencé sur le milieu composé par Wright ; un ensemencement de contrôle est pratiqué sur gélose giycérinée. Après quarante-huit heures apparaissent quelques petites colonies blanchâtres sur le milieu spécifique. Ces colonies, à l'examen microscopique, se montrent composées de diplocoques en biscuit ressemblant au gonocoque de Neisser, au point de vue morphologique et tinctorial. Les colonie repiquées sur sérum sanguin, gélose et gélatine, ne poussèrent pas. Les colonies repiquées sur le milieu spécifique le premier jour poussèrent, celles repiquées plus lard ne poussèrent pas.

Pas de colonies sur gélose glycérinée.

Le sang est ensemencé les 20, 2% mai et 1° avril. Les deux premières fois, des colonies poussent qui sont en tout semblables à celles du

premier ensemencement. L'ensemencement du 4° avril reste négatif.

OsservarTioN IT (Hewes, 1894) Arthrite blennorragique avec fièvre

G. À... entre salle 7 du Massachusets General Hospital, le 20 août. Le 25 août, le sang est ensemencé sur gélatine acide de Turro. Trois

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jours après, plusieurs petites colonies apparaissent; elles ont une teinte légèrement jaunâtre; elles ne tardent pas à s'étendre. Repiquées sur agar, sérum sanguin et gélatine, elles se reproduisent. Les micro-organismes de ces colonies sont des diplocoques en biscuit, ressemblant au gonocoque de Neisser aux points de vue morphologique et tinctorial. Le sang est de nouveau ensemencé le 30 août, les 4, 8 et 20 septembre. Chaque fois, sauf la dernière, les colonies obtenues sont pareilles à celle de la première culture. Les cultures du 30 août furent reproduites jusqu’à la quatrième génération, et la dernière génération inoculée à la muqueuse vaginale d'une chienne. Trente-six heures plus tard, un écoulement puriforme était visible à l’orifice vaginal et sur la muqueuse. L'examen bactériologique de cet écoulement révèle la présence de diplocoques en biscuits intra et extra-cellulaires. Des colonies nettes sont obtenues également avec cet écoulement purulent. Une seconde inoculation est faite, avec la quatrième génération de la culture du % septembre, sur la muqueuse vaginale d’une chienne, avec un résultat identique. L'inoculation, dans les deux cas, à été faite par

frottis de la membrane.

Ogservarion IIT (FINGER, GHON, SCHLAGENHAUFER, 1895)

Endocardite et arthrite blennorragiques

Charles S..., dix-neuf ans, est reçu le 27 avril à l'hôpital général de Vienne.

L'examen du sang, pratiqué une heure et demie avant la mort, montre une leucocytose polynucléaire intense. La préparation passée à la flamme et colorée au bleu de méthylène montre de fines granulations, pas de bactéries.

A l’autopsie, faite avec les précautions convenables pour recueillir les pièces sans les contaminer, la cavité thoracique fut ouverte avec des instruments stérilisés. Le ventricule gauche fut ouvert tout à fait aseptiquement ; quelques centimètres cubes de sang y furent immédiatement pris et de gros fragments des enduits de lendocarde enlevés avec des pinces flambées. La veine cave inférieure fut ouverte d’une façon

absolument aseptique pour y prendre du sang.

Les matériaux ainsi recueillis furent en partie employés à l'examen immédiat sur lamelles et en partie employés à faire des cultures.

Examen microscopique. — Les lamelles, colorées au bleu de méthylène et soumises aussi au contrôle de la méthode de Gram donnèrent les résultats suivants :

Enduits de l’endocarde: la préparation montre des coccus assez nombreux en forme de diplocoques, ayant l'aspect et le groupement typique du gonocoque, facilementdécolorés par le Gram, les uns inclus de la façon typique dans les leucocytes, la plupart libres. Ceux-ci forment souvent de gros amas, dont la disposition irrégulière, l'aspect variable déterminé surtout par l'intensité avec laquelle ils prennent et gardent les colorants, rappellent vivement l’aspect si caractéristique des lamelles faites avec des cultures de gonocoques.

Cultures. — N'ayant pas de sérum humain ni d’agar-urine, nous ensemençons en stries tous les fragments prélevés sur un mélange d'agar-peptone et de sérum de bœuf coulé dans des boîtes de Pétri; le tout est laissé quarante-huit heures à l'étuve à 37° C.

1° Enduits de l’endocarde: a) valve postérieure de laorte: un fragment assez gros est bien brové dans une petite quantité de bouillon stérilisé; le milieu reste complètement stérile ; b) un fragment de la valve droite est de même bien broyé dans du bouillon qui reste aussi stérile.

2 Sang: a) du ventricule gauche: le milieu resta stérile; b) de la veine cave: le milieu resta stérile. Plusieurs boîtes de Pétri, du même milieu agar-sérum de bœuf de la même provenance furent ensemencées avec du pus de blennoragie aiguë, avèc des cultures pures de staphylococcus pyogenes aureus. Le résultat fut positif.

Les végétations des valvules dureies dans Palcool furent colorées suirant la méthode de Lœîfler, au bleu de méthylène boracique avec différenciation dans l'acide acétique à 5 pour 100 par les méthodes de Pfeiffer, Gram et Weigert.

Dans les parties périphériques de la végétation, on trouve un grand nombre de coccus qui présentent la forme caractéristique de diplocoques en grains de calé et sont presque tous inclus dans le protoplasma des cellules de pus. Tous ces coecus, après une double décoloration par le Gram ou le Weigert, perdent immédiatement et complètement leur

coloration, À côté d'un grand nombre de diplocoques fortement colorés,

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en forme typique de haricots, à côté d’autres en racines, s’en trouvent de plus gros, comme gonflés, pâles et peu colorés, et un grand nombre de coccus ronds, petits et bien colorés, ou gros et pâles.

Les gros amas où les coccus se comportent comme dans les cultures ne se voient que là où la structure du thrombus ne met aucun obstacle à leur multiplication. Dans les fentes, on voit les diplocoques s'avancer paire par paire, se disposant en longue colonne.

Ogservarion IV (Tuayer et BLumer, 1895)

Endocardite ulcéreuse blennorragique. Septicémie d’origine blennorragique

Examen bactériologique. — L'examen des lamelles faites des végétations de la valvule mitrale a montré un nombre considérable de leucocytes polynucléaires et quelques-uns grands et petits, mononucléaires, aussi bien qu'une quantité d'une substance finement granuleuse. Entre les éléments cellullaires, il y a un grand nombre de bactéries composées de petits diplocoques ovales, se trouvant côte à côte, ayant souvent la forme de biscuit, les côtés opposés étant concaves. Parfois il existe des pseudo-chaïînettes de trois ou quatre éléments et rarement ces organismes sont groupés par quatre. Les leucocytes polynucléaires, presque sans exception, contiennent des diplocoques. Il n’y avait pas de bactéries dans les leucocytes mononucléaires grands ou petits. Ces microcoques avaient les caractères morphologiques des gonocoques.

Les lamelles colorées de violet de gentiane (qui colorait facilement les microcoques), puis traitées par la solution de Lugol et l'alcool (méthode de Gram) se sont décolorées complètement ; pas un micro-organisme n’a retenu la couleur.

L'examen de lamelles enduites de mueus vaginal et utérin montra les mêmes diplocoques qui se décolorent quand ils sont traités par la méthode de Gram.

Cultures. Pendant La vie (4 mai 1895). — Les cultures prises du sang furent faites d’après la méthode de Sitzmann. Le sang fut pris de la veine médiane basilique avec une seringue qu'on avait fait bouillir pen-

dant vingt minutes. Le bras avait été bien lavé auparavant à l’eau et au

savon et enveloppé d'une compresse au sublimé à 1 pour 1000. Environ 2 centimètres cubes de sang furent mêlés avec de l’agar-agar.

Il n’y eut aucun développement.

Le 7, d'autres tentatives de cultures furent faites de la même manière ; le mélange sur les plaques contenait au moins un tiers de sang.

Après quarante-huit heures à l’étuve, on pouvait voir des petites colonies blanches de la grosseur d’une pointe d’épingle. L'examen de ces colonies montra de petits diplocoques ovales, parfois couchés côte à côte, en forme de biscuit. On réensemença sur agar-agar, gélatine, pommes de terre, bouillon et tournesol, lait. Aucun développement.

Le 12, on fait des cultures d’après la même méthode, avec le même résultat. On obtint une culture du même microcoque. Des colonies pareilles furent trouvées sur les plaques, avec les mêmes résultats négatifs dans les tentatives de réensemencement.

A l'autopsie. — Des cultures sur l’agar-agar et le sérum de sang de bœuf, faites avec le sang du cœur, furent entièrement négatives ; une très petite quantité de sang fut ensemencée. Le laboratoire était à cette époque dépourvu des milieux nécessaires au développement du gonocoque. La ressemblance extraordinaire des organismes trouvés dans les végétations sur la valvule mitrale, avec le gonocoque, et sa réaction caractéristique avec les matières colorantes corroborent les résultats négatifs obtenus en essayant de transplanter les colonies obtenues pendant la vie. En examinant encore ces cultures, les colonies furent trouvées composées d'organismes ressemblant tout à fait à ceux trouvés dans le thrombus sur la valvule. Ils montrèrent les mêmes réactions colorantes, se décolorant immédiatement par la méthode de Gram. Si l’on considère la quantité considérable de sang employé, on peut facilement se dire que le milieu n’était pas essentiellement différent de celui recommandé par Wertheim. Les développements sur ce milieu

furent abondants, tandis que des transplantations sur des milienx ordinaires demeurèrent sans résultat.

Le 17, les transplantations furent répétées sur du sérum et de l'urine de l’homme, sur du sérum de bœuf, sur l’agar-agar et l'urine, l'extrait de fœtus (Flexner) et agar-agar, mais les organismes ne se développèrent pas. Ces milieux ensemencés avec des gonocoques avaient réussi.

La conclusian est que le sixième jour les organismes étaient morts.

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L'examen microscopique des préparations après durcissement donne les résultats suivants: aux valvules, on y constate une endocardite subaiguë. Dans toutes les coupes du tissu inflammatoire on trouve des diplocoques en petit nombre, en moindre quantité qu’on ne pourrait le penser d’après l'apparence des préparations faites sur lamelles de verre; leur petit nombre est évidemment dû à ce qu'ils se décolorent si facilement. Ces diplocoques sont parfois ovales et paraissent disposés bout à bout, quoiqu’on les voie souvent côte à côte, en forme de biscuit. Les diplocoques existent au niveau des loyers les plus aigus et où les noyaux sont fragmentés. Parfois les organismes sont en dehors des cellules, parlois.en dedans des leucocytes polynucléaires. La surface de la valvule est recouverte d’un caillot sanguin dans lequel on a constaté un très petit nombre de diplocoques ; ces diplocoques paraissent libres dans le sang et non inclus dans les leucocytes. Coiïffant ce caillot, dans maints endroits se trouve une substance finement granuleuse qui rappelle l'apparence des hématoblastes qu'on voit parfois dans les thrombus. Ce tissu se colore bien par l’éosine, el aussi par les couleurs d’aniline employées pour la coloration des bactéries.

Expérience sur les animaux. — Une souris fut inoculée à la base de la queue avec un morceau de thrombus de la grosseur d’un grain de chènevis; le résultat fut négatif.

Ces résultats justifient, nous le croyons, l'hypothèse que l'organisme isolé en culture pure dans le courant sanguin et sur les valvules alfectées était bien le gonocoque de Neisser :

a) Sa forme et sa disposition étaient caractéristiques.

b) Quoique parfois libres, les microbes furent souvent trouvés accumulés dans le protoplasma des leucocytes du thrombus sur la valvule.

c) Ce microorganisme ne put se développer sur les milieux ordinaires.

d) IL se développa facilement sur un mélange de sang humain et d’agar-agar (un tiers de sang).

e) I se décolorait par le Gram. Nous n'avons point de données sur la porte d'entrée du virus. Mais l'examen microscopique du vagin et cle l’intérieur de l'utérus ayant montré des diplocoques pareils, se décolorant par méthode de Gram, il y a peu de doute que l'infection n'ait eu

lieu par les voies ordinaires.

OgservarTion V (GrirroN, 1895) Arthrites suppurées à gonocoque

L'enfant M.…., née le 41 août 1895, entre le 2 septembre 1895 a l'hôpital. Le 8, on fait l'analyse bactériologique du sang de la circulation générale : on aspire, avec une seringue qui, pendant dix minutes, a séjourné dans l’eau bouillante, du sang au niveau de la veine du bras gonflée par une ligature appliquée au-dessus du coude. La peau a été soigneusement lavée, savonnée, passée à l’éther et à l'alcool, et, au point où doit passer l'aiguille de la seringue, on a appliqué la pointe du thermocautère. Le sang, ainsi aseptiquement recueilli, est ensemencé sur un tube de gélose glycérinée. On fait aussi quelques lamelles avec ce sang, mais les examens répétés révèlent l'absence de tout microbe.

Le 9, rien n’a poussé ; les jours suivants, les tubes ensemencés avec le sang sont examinés à différentes reprises, aucune culture n'apparaît.

À lautopsie, deux tubes ensemencés avec le sang du cœur demeurent stériles. 1

Ogservarion VI (Gouazr, 1895) Arthrite et phlébite blennorragique

L'examen du pus utérin et urétral montre des diplocoques se décolorant par le Gram.

Un peu de sang prélevé par piqûre sur l'index gauche est examiné au microscope et ensemencé sur gélose au sang humain. L'épreuve reste négative.

Ogservarion VIT (Dauger et Bonsr, 1895)

(Résumée dans la thèse de M. Sfr)

Endocardite maligne

« Dauber et Borst trouvèrent dans les valvules des coccus et diplocoques décolorés par le Gram. Toutes leurs cultures restèrent stérilss, sauf une faite sur agar-sérum de Kraf où se développa une colonie puneti-

forme, brun jaunâtre, transparente, à bords nets, mais sans prolonge-

DT: Se ment au pourtour ni cultures filles. Arens, consulté sur la nature de cette colonie, aurait affirmé qu'il ne s'agissait pas de gonocoques. Les caractères qu'ils décrivent ressemblent pourtant beaucoup à ceux du microbe de Neisser; nous savons, notamment, que ses cultures peuvent rester rondes et sans prolongements. »

OBservATION VIIT (Armanx, 1896) Rhumatisme blennorragique avec fièvre

Recherche du gonocoque dans le sang. — Après désinfection chirurgicaie de la peau et constriction du bras, une aiguille de seringue de Pravaz stérilisée est enfoncée dans une veine du pli du coude droit : 1 gramme de sang est aspiré. La plus grande partie de ce sang est, avec des précautions d’asepsie, versée en couche assez épaisse sur géloseascite dans quatre boîtes de Pétri. Avec quelques gouttes restantes on fait des préparations dans lesquelles on cherche des bactéries après coloration au bleu de méthylène et au Gram, sans résultat. Les quatre boîtes de Pétri montrent, après deux heures de séjour à lPétuve à 30°, un peu plus de 30 colonies analogues à des colonies de gonocoques. Comme ces colonies avaient en partie poussé dans le sang, elles n'avaient pas exactement l'aspect habituel des colonies de gonocoques. Un repiquage de ces colonies sur gélose-ascite donna, après un jour, une deuxième génération de colonies de gonocoques facilement reconnaissables. En même temps, les colonies des plaques avaient cru considérablement; sur les bords des traîinées de sang elles s'étaient développées sur les régions non recouvertes de sang el là, alors, avaient un aspect plus caractéristique. Elles furent suivies ensuite sur plusieurs générations et contrôlées microscopiquement par le Gram et par essais de culture sur d’autres milieux.

J'insiste sur l'importance de prendre une assez grande quantité de sang : les résultats négatifs des auteurs sont dus sans doute à ce qu'ils

avaient seulement frotté sur le milieu un fl de platine trempé dans le

sang.

Inoculation. — Chez un jeune homme consentant, qui n'avait pas et

n'avait jamais eu la blennorragie, la cinquième génération des cultures