ON ARE

Plusieurs fois on a observé chez les animaux en cours d’immunisation l’apparition des symptômes tétaniques qui, le plus Souvent, ont cessé spontanément. :

Le cas de tétanos humain cité par M. Behring a été recueilli par M. Rotter. Ce cas fut guéri par une injection de 250 ce. de sérum antitoxique, mais la maladie était peu grave et M. Rotier croit qu’elle était curable par les moyens ordinaires.

En somme, toutes les publications récentes sur la sérothérapie du tétanos nous montrent combien les guérisons deviennent difficiles, puisque les résultats semblent moins favorables à mesure que l’activité des sérums employés augmente, ce qui démontre la nécessité d’une étude expérimentale et systématique avant l'application à l’homme d’un procédé thérapeutique dont les conditions sont encore mal définies (1).

(1) La presque totalité de notre historique a été empruntée au savant mémoire que MM. Roux et Vaillard ont publié dans le n° du 25 février 1893 des Annales de l'Institut Pasteur, sous ce titre: Contribution à l'élude du tétanos.

Comment on confère au sang des animaux les propriétés antitoxiques.

Lorsque Behring et Kitasato publièrent les conclusions que nous avons exposées dans les premières pages de notre historique, ils n'avaient encore en leur pouvoir aucune méthode précise de vaccination.

Tizzoni et Cattani, les premiers, parvinrent à vacciner quelques animaux, pigeons et chiens, contre le tétanos, en leur injectant, à doses très faibles, des cultures vivantes de tétanos. Leurs expériences confirmèrent d'ailleurs en tous points les conclusions de Behring et de Kitasato, mais qu’elles étaient loin encore d'aboutir à des résultats pratiques!

Vaillard, utilisant la méthode mise en pratique par Frankel à propos de la diphtérie, réussit à vacciner quelques lapins. Il leur injectait des cultures filtrées de tétanos, chauffées pendant une heure à 60°. Le poison tétanique, modifié par la chaleur au point de ne plus pouvoir provoquer le tétanos, même à forte dose, acquiert la propriété de conférer l’immunité. Si on pousse le chauffage jusqu’à 65°, les cultures ainsi traitées perdent cette même propriété. :

Kitasato décrivit plus tard un procédé de vaccination qui consistait en inoculations aux lapins des cultures vivantes et virulentes du tétanos, mêlées à des doses progressivement décroissantes de trichlorure diode. Mais ce procédé n’est pas inoffensif, il faut graduer les injections avec prudence pour

=: | Mes éviter que les animaux ne deviennent tétaniques au cours de l'expérience. Encore n'est-on pas sûr que tous les animaux bénéficieront d'une immunité véritable.

Poursuivant leurs recherches, Brieger, Kitasato et Wasserman ont préparé, par un mélange d'extrait de thymus à la culture filtrée du tétanos, un vaccin parfaitement inoffensif, à la condition d’être administré, vieux de deux jours, à des doses progressivement croissantes.

Cette méthode, que ses inventeurs considéraient comme la seule véritablement efficace, le cède pourtant à plusieurs autres que M. Vaillard a longuement exposées dans un article paru dans le tome VI des Annales de l'Institut Pasteur et dont nous allons résumer les points principaux.

Un des procédés de M. Vaillard utilise les propriétés vaccinales que possèdent les cultures filtrées du microbe, lorsqu’elles ont été partiellement dépourvues de leur toxicité par le chauffage ; il consiste à introduire dans le sang des doses massives de cultures filtrées, chauffées à des températures progressivement décroissantes, 60°, 55°, 50°, puis des quantités graduellement augmentées de cultures filtrées dont la toxicité est entière. L'application en est facile. À trois jours d'intervalle, on injecte dans une veine de l'oreille deux doses de 10 cc d’une culture filtrée, chauffée pendant une heure à 60°. Cinq jours après, on injecte 10 cc. de la même culture, mais chauffée pendant une heure à 55°; enfin, après un nouveau délai de cinq jours, 10 cc. de la culture chauffée une heure à 50°.

Cela suffit déjà pour donner l'immunité aux animaux et conférer au sang la propriété antitoxique. L'état réfractaire est ensuite renforcé au moyen de cultures filtrées douées de toute leur toxicité; pour cela, tous les huit ou dix jours, on en injecte dans l'oreille des quantités croissantes, 5, 10, 15, 20, 30 cc. et même plus, si besoin est.

use

Un procédé plus simple encore, et plus expéditif que le précédent, consiste à employer non plus la toxine atténuée par la chaleur, mais la toxine modifiée par l’iode. M. E. Roux, dans son discours sur l’immunité au Congrès de Londres, à mentionné ce moyen de l’immunisation facile, pratique et qui donne des résultats également certains pour le tétanos et la diphtérie.

L’'iode à faible dose neutralise ou modifie instantanément le poison tétanique.Si, à 0 cc. 5 d’une culture filtrée dont 1/6000 de centimètre cube suffit pour tuer un cobaye adulte, on ajoute un volume égal d’eau iodée à 1/500, on peut immédiatement après injecter la totalité du mélange sous la peau d’un jeune cobaye sans déterminer le moindre symptôme tétanique. Après quelques injections de ce genre comportant des doses croissantes de culture, les animaux acquièrent l’immunité, et cette immunité se maintient encore après huit mois.

Il n'est pas jusqu'à linjection de doses progressives de cultures filtrées dont la toxicité est entière qui ne puisse conférer l’immunité par le fait d’une accoutumance graduelle au poison. Ce procédé ne réussit, d’ailleurs, qu’à la condition d'être appliqué avec ménagement et sans précipitation.

Le procédé d’immunisation par la toxine iodée est de tous peut-être le meilleur. Plus lanimal que l’on veut vacciner est sensible au tétanos, plus on prolongera les injections de toxine iodée. Ainsi on ne commencera à injecter à un cheval de la toxine pure que lorsqu'on aura constaté que son sang est antitoxique.

Il serait erroné de croire que, par ce seul fait que l’on a immunisé un animal contre le tétanos, on a du même coup transmis au sérum de cet animal les propriétés antitoxiques. Ainsi, par exemple, le sang des lapins rendus réfractaires par des inoculations répétées de cultures vivantes addition-

nu jose nées d'acide lactique sous la peau de la queue ou du tronc ne présente généralement pas de propriétés antitoxiques appréciables. C’est que, comme l’a démontré Ehrlich, la propriété antitoxique du sérum n’est pas une quantité invariable, mais bien un attribut artificiel, contingent, intimement lié à la pénétration dans l’organisme de doses plus ou moins grandes de substances élaborées par le bacille tétanique.

En réalité, la dose de culture injectée importe seule. Chez certains animaux appartenant à la même espèce, il faut néanmoins des doses de culture différentes pour faire apparaître la propriété antitoxique du sérum dans toute sa plémitude. Celle-ci, d'autre part, ne devient pas manifeste aussitôt après l'introduction de la culture filtrée dans les tissus de l'animal, et le sang reste toxique pendant un certain temps.

La propriété antitoxique ne s'établit que lentement, progressivement ; déjà appréciable du huitième au douzième jour, elle se montre très active du dix-huitième au vingtième jour, toujours d’autant plus marquée que la masse de culture injectée a été plus considérable. Une fois établie, elle persiste pendant quatre, six et même huit mois; lorsqu'elle commence

à diminuer, il suffit d’une nouvelle injection pour la faire remonter à son énergie première.

M. Behring s’est servi, pour indiquer l'activité d’un sérum, d’une notation très commode et qu’il est bon d'adopter. Il mesure cette activité d'après la quantité de sérum nécessaire pour immuniser { gramme de souris. Quand il dit d'un sérum qu’il est actif au millionième, cela veut dire qu'un centimètre cube de ce sérum suffit à immuniser 1,000 kilogrammes de souris; ou encore qu’une souris de 20 grammes sera rendue réfractaire par l'injection de ? cent-millièmes de centimètre cube du même sérum.

Le pouvoir antitoxique se mesure in vitro, d’après la quan-

221 DE tité de sérum nécessaire pour rendre inoffensif un volume donné d’une toxine dont l’activité est connue.

Le pouvoir antitoxique du sang des animaux immunisés décroit dès que l’on suspend les injections de toxine. Il importe donc de faire périodiquement des injections de toxine aux animaux qui le fournissent. Non seulement on empêche ainsi l’affaiblissement des pouvoirs antitoxiques et immunisants, mais on l’accroît sans cessé en proportion des quantités de toxine injectée, et il semble que l’expérimentateur puisse ainsi l’augmenter indéfiniment.

M.Behring fait remarquer que chaque injection de toxine est suivie d’une diminution du pouvoir antitoxique du sérum, puisque une partie de l’antitoxine est aussitôt employée à détruire la toxine injectée. Si la dose de poison introduite d’un seul coup est très considérable, ou si les injections sont abondantes et renouvelées tous les jours, la propriété antitoxique du sang disparaîtra momentanément. Il peut même arriver que le sang devienne toxique et que le pouvoir antitoxique ne reparaisse qu'au bout de quinze jours Une remarque intéressante à faire sur ce point, c’est qu'un cheval inoculé du tétanos au moment où son sang charriait des torrents de toxine n’a pas pris la maladie. Cette immunité, qui n’a rien à voiravec l'immunité antitoxique en un pareil moment, doit provenir d’une accoutumance au poison.

En procédant par injections massives (50 cc. pour un lapin, 200 à 300 cc. pour un cheval), espacées de dix en dix jours, on élèvera continuellement le pouvoir antitoxique et l’on pourra puiser le sérum une dizaine de jours après l’opération. M. Nocard, utilisant ces principes, a vacciné des chevaux et une vache pouvant fournir pour le traitement du tétanos humain un sérum dont le pouvoir antitoxique est de 10,000,000, degré d'activité que M. Behring regarde comme particulièrement favorable aux essais thérapeutiques.

MO TEE

Pour garder le sérum en provision, on peut le dessécher

dans le vide et le conserver à l’état sec; au moment de s’en

servir, il est dissous dans dix fois son poids d’eau distillée

stérile. La dessiccation ne diminue pas son efficacité et permet de le conserver indéfiniment.

HI

Propriétés du sérum antitoxique

Il est bien établi, depuis les expériences faciles à vérifier et déjà devennes classiques de MM. Behring et Kitasato, que si l'on mélange parties égales de sérum antitoxique et de toxine tétanique mortelle pour le cochon d'Inde, à la dose de 0 cc. 003, et si l’on injecte des volumes de ce mélange contenant ? cc., 3 ce., 6 cc. de culture filtrée à des cobayes, ceuxci ne présenteront, dans la suite, aucun symptôme de tétanos. | L'action du sérum s’exerce d’ailleurs aussi bien dans l'organisme vivant que dans les verres à expérience. A lieu de pratiquer d'avance le mélange, injectons d'emblée 120 cc. de culture filtrée à un lapin immunisé et recueillons le sang de ce lapin trente minutes après cette opération, ce sang immunisera les souris auxquelles nous l’injecterons, loin de leur donner le tétanos.

Quel est donc le mode d’action de cette substance antitoxique du sérum sur les toxines tétaniques ?. Forme-t-elle avec cette toxine une combinaison définie, à la façon d’un acide qui sature un alcali; provoque-t-elle, à la façon des ferments, un dédoublement de cette toxine ? À vrai dire, nous n’en savons rien et nous n'avons aucune idée de la quantité réelle d’antitoxine contenue dans un volume de sérum, pas plus d’ailleurs

me HU que nous ne savons la dose de toxine contenue dans un volume de culture filtrée.

Jusqu’ici nous n'avons pu constater et aflirmer qu’une chose, c'est l’action incontestable du sérum antitoxique sur les cultures toxiques, action qui se manifeste écalement in vitro et dans l’organisme des animaux. Aucun artifice n’a réussi jus- - qu'à présent pour séparer la toxine et l’antitoxine versées l’une dans l’autre; ni la filtration sur terre poreuse, ni la dialyse, niles précipitations n’ont donné de résultats. La toxine tétanique, qui passe en partie à travers le parchemin quand elle est dans du bouillon, ne dialyse plus si elle est mélangée à un liquide albumineux, et tout ce-que Tizzoni et Cattani ont pu retirer de leurs études spéciales sur le sérum antitoxique, c'est que l’antitoxine est affaiblie par le chauffage à 65° pendant une demi-heure, et détruite par le chauffage de la même durée à 68, température de coagulation du sérum. Ils ont trouvé également qu’elle est détruite par l'acide chlorhydrique, par l'acide lactique en excès, par les alcalis ; qu’elle est précipitée par le sulfate d’ammoniaque en excès et par l'alcool absolu.

Il faut ajouter que les propriétés physiques et chimiques de la toxine et de l’antitoxine sont très analogues et que les mêmes agents les détruisent dans la même proportion. Dès lors il est bien malaisé de savoir si un animal qui reçoit un mélange de sérum et de culture filtrée reste indemne parce que le poison-n’existe plus dans le liquide inoculé, ou bien parce que le sérum immunisant a rendu ses cellules insensibles à la toxine qui reste alors sans effet. Et cependant toutes les expériences sont bien faites pour laisser croire que ces deux substances se détruisent mutuellement.

L'action de l’antitoxine sur la toxine est instantanée. Le mélange, une fois fait, devient immédiatement inoftensif.

Si l’on verse des quantités graduellement croissantes de

CRT es toxine dans un volume donné de sérum, il arrive un moment où le sérum perd ses propriétés antitoxiques ; le liquide contient un excès de toxine et peut donner le tétanos.

L’injection d’un peu de sérum à un animal sensible, si elle est faite quelques heures avant l'infection, lui permet de résister à une dose de culture sûrement mortelle pour les animaux de même poids. On peut obtenir des sérums qui immunisent à des quantités infiniment petites. M. Nocard a immunisé un cheval dont le sérum est actif au dix-millionième de cc. Cette minime portion n’est préventive que pour une dose déterminée de toxine, elle serait insuffisante pour une dose plus grande.

En augmentant le volume du sérum injecté proportionnellement à celui de la toxine que l’on veut employer, on rendra les animaux insensibles à des masses de poison tétanique.

Le sérum confère donc aux animaux une immunité véritable, comme l'ont établi MM. Brieger et Kitasato ; mais contrairement à l'opinion de ces auteurs, cette immunité n’est pas durable, elle diminue rapidement, quelle que soit la quantité de sérum injectée et elle disparaît dans un délai qui, dans les expériences de M. Vaillard, n’a guère dépassé cinquante jours.

Ainsi un cobaye, du poids de 530 grammes, reçoit dans le péritoine 20 cc. d’un sérum actif à O0 cc. 00002; trente-sept jours après, l’inoculation d’une quantité modérée de culture filtrée provoque chez ce cobaye un tétanos sévère, mais dont il guérit. Une souris de 15 grammes reçoit un cc. d’un sérum actif au millionième ; éprouvée au bout de vingt-quatre jours avec une petite dose de toxine, elle meurt tétanique. Parfois même, chez les cobayes auquels on n’a donné que ? à 3 cc. de sérum, l'immunité prend fin dès le quinzième ou le vingtième jour.

Cette immunité est acquise immédiatement après l’intro-

me ut duction du sérum antitoxique, elle est proportionnelle à la dose de celui-ci.

Elle diffère essentiellement de l'immunité lente à s'établir, mais persistante, que l’on obtient par linjection de la toxine iodée où chauffée, ou encore par l'injection dans le tissu cellulaire de spores tétaniques et d'acide lactique. Chaque fois que les cellules de l'organisme ont subi l’action de la toxine tétanique, elles conservent longtemps leur résistance vis-à-vis d'elle, alors même que le sang ne manifeste pas de propriétés antitoxiques.

Cela prouve bien que l'immunité dans le tétanos n’est pas tout entière dans le pouvoir antitoxique des humeurs. Il y a en réalité plusieurs sortes d’immunités contre le tétanos, et limmunité antitoxique est celle qui apparaît en dernier lieu chez les animaux hypervaccinés par les procédés que nous avons décrits.

Comment se forme l’antitoxine dans le corps des animaux ? Elle abonde dans le sang des animaux seulement après des injections prolongées de toxine. Serait-elle une simple modification de cette dernière ? Question intéressante, mais insoluble. On sait cependant que la substance antitoxique existe surtout dans le sang ou plus exactement dans le sérum, car M. Behring a prouvé que le caillot n’en renferme pas.

La sérosité limpide et privée d'éléments cellulaires d'un ædème provoqué chez le lapin vacciné, par une ligature placée à la base de l’oreille est aussi antiloxique que le sang. L’humeur aqueuse d’un animal immunisé est antitoxique, mais plus faiblement.

L’urine et la salive sont quelque peu antitoxiques chez les. animaux, même hyperimmunisés. Le lait, au contraire, est très riche en antitoxine et agit comme le sérum, ainsi que la très ingénieusement démontré M. Ehrlich, qui attribue à la lactation la transmission héréditaire de l'immunité tétanique.

Hope

Toutes les recherches faites sur les organes n'ont pas donné de grands résultats; les ganglions lymphatiques, le foie, la rate, le thymus, les capsules surrénales, le pancréas, les glandes salivaires et lacrymales ont détruit in vitro la toxine tétanique, sans qu'aucun organe déterminé parût être le siège où se fabrique plus spécialement l’antitoxine. Les muscles n’ont donné aucune réaction.

Le pus des animaux immunisés a révélé des propriétés anlitoxiques, mais on à le droit de se demander si ces propriétés tiennent aux leucocytes ou à la petite quantité de sérosité qui se trouve avec eux. En effet, si on lave soigneusement à diverses reprises les amas purulents dans une solution physiologique de chlorure de sodium, leur propriété préventive diminue fortement.

La substance antitoxique s’élimine par le rein et par le lait, surtout chez les femelles. Malgré ces causes de déperdition, on en trouve encore dans le sang des animaux immunisés longtemps après la cessation des injections vaccinantes.

De même on peut extraire en quelques jours, des vaisseaux d’un animal immunisé, une quantité de sang égale à la masse totale de ce liquide, sans que l’activité du sérum soit sensiblement diminuée. Il faut en conclure que l’antitoxine enlevée à chaque saignée a été remplacée, et retenir ce fait pratique, à savoir que, chez un animal fournisseur de sérum, les saignées peuvent être fréquentes et copieuses, sans que, de ce fait, le pouvoir antitoxique soit notablement diminué.

De l’action des humeurs d’un animal immunisé contre le tétanos sur le virus de cette maladie.

On sait que le sang des animaux immunisés contre le tétanos possède la propriété de détruire in vitro le poison tétanique et de préserver les animaux, non seulement contre la toxine provenant de souillures, mais encore, ce qui est difrérent, contre le virus lui-même inoculé suivant des procédés conformes à ceux de l'infection naturelle.

De là toute une théorie de l’action des humeurs et du sérum antitoxique sur les virus, théorie qui a rencontré de nombreux défenseurs et dont nous allons montrer l’inanité en rapportant les expériences très démonstratives de M. le professeur Vaillard et les conclusions qu'il en a tirées.

Le tétanos présentant au plus haut degré les phénomènes d’immunisation, c’est sur l'agent pathogène de cette maladie qu'on a cherché de préférence à constater l’action que pouvaient avoir sur le bacille les humeurs des animaux réfractaires.

1° Le bacille tétanique végète et il élabore sa toxine dans le sérum des animaux réfractaires.

Le sang des cobayes ou lapins rendus réfractaires au tétanos se prête, comme le sang des animaux non réfractaires, à la végétation du bacille tétanique et à l’élaboration de sa toxine. Ce sang possède un pouvoir antitoxique et immunisant

LLMBR SE dont le coefficient peut être considérable, et cependant le virus que l'on y sème, loin de périr, se développe sans rien perdre de son aptitude à secréter le poison spécifique.

Les spores ne subissent aucune influence de la part du sérum antitoxique; elles y végètent aussi bien que dans le sérum d’un lapin réceptif,en produisant une toxine dont Pactivité est établie par l’inoculation aux animaux ;

2° Le virus tétanique se multiplie dans les tissus vivants d’un animal immunisé.

Ce n'était pas assez de démontrer que les virus se développent librement dans une culture de sérum antitoxique extrait des vaisseaux d’un animal; il fallait se rendre compte si cette prolifération du virus était possible également au sein des tissus vivants. Mais ici la difficulté était considérable, car les spores tétaniques injectées dans les tissus d’un animal immunisé sont promptement englobées par les leucocytes et détruites par eux. Il fallait donc soustraire ces spores à l’action des phagocytes, mais en les laissant au contact du liquide organique qui circule dans le tissu conjonctif.

La difficulté a été merveilleusement tournée : Sous la peau du ventre d’un cobaye parfaitement immunisé on insère avec la plus rigoureuse asepsie un étui de papier contenant du sable imprégné de spores chauffées à 80° pendant trois heures:

Un étui semblable est disposé de la même façon sous la peau d’un cobaye témoin. Le témoin est pris de tétanos le troisième jour et meurt quarante-huit heures après. Au sixième jour le cobaye réfractaire est encore indemne, et l’on constate en extrayant le sac de papier:

a) Que les tissus environnants n'offrent aucune réaction ;

b) Qu'on ne rencontre à la surface du sac aucun bacille tétanique ;