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qu’il y ait rupture du filtre, accident pour ainsi dire inévitable si l’on veut se servir de la trompe.

On entoure l’entonnoir en verre d’un autre entonnoir en fer-blanc. L’in- -tervalle est rempli de glace, que l’on renouvelle de temps en temps. J'ai pu faire ainsi rapidement des lavages multiples sans avoir de décomposition de la matière colorante qui doit conserver sa belle couleur rouge brique.

Quand les eaux de lavages ne précipitent plus ni par le sublimé, ni par le nitrate d'argent, ni par l’acétate triplombique, on distrait une petite quantité de matière que l’on calcine, afin de s’assurer, au moyen du molybdate d’ammonium, que les cendres ne contiennent plus de phosphore.

Une deuxième et une troisième cristallisation sont nécessaires. Si l’on est parti, par exemple, de deux litres de sang de cheval, le rendement est si abondant qu’on peut aisément se résigner aux pertes considérables qu’entraînent ces cristallisations répétées.

On introduit le filtre tout entier, avec les cristaux, dans un flacon à large col, et l’on ajoute de l’eau distillée à 25°. Une agitation prolongée est souvent nécessaire pour achever la dissolution. Le liquide filtré, refroidi à 0°, est additionné du quart de son volume d’alcool également refroidi. Le tout est remis pendant huit à dix heures dans un mélange réfrigérant.

Les cristaux purifiés sont finalement redissous dans de Peau, et la solution obtenue est répartie dans de petits ballonnets à long col que l’on étire à la lampe, en ayant soin de laisser aussi peu d’air que possible.

Tel est le procédé qui m’a servi à la préparation des liqueurs normales. J’ai opéré sur du sang de cheval et du sang de chien et toujours fait trois recristallisations, soit en tout quatre cristallisations successives.

Le titre de ces solutions normales est obtenu de la facon suivante : on introduit dans un petit vase de Bohême 25 ou 30 cent. cubes de la solution, et on évapore dans le vide en présence de l’acide sulfurique et à une basse température; on se sert pour cela d’un dessicateur à vide formé d’une sorte de cristallisoir contenant de l’acide sulfurique, et sur lequel s’adapte hermétiquement une petite cloche terminée par un tube à robinet. Le vide est obtenu et maintenu à laide d’une petite trompe d’Alvergniat. La cloche toute entière, entourée de glace pilée que l’on renouvelle deux ou trois fois par jour, est introduite dans une petite glacière munie d’une portière vitrée,

et dans laquelle circule un courant d’eau froide. Au bout de six à huit jours, la solution est complètement desséchée. On achève la dessication à 112° dans une étuve à air, jusqu’à ce que le poids du résidu reste constant. Ce résidu est constitué par de l’hémoglobine sèche.

PROPRIÉTÉS PHYSIQUES. — Les cristaux d’oxyhémoglobine ainsi obtenus sont transparents, brillants et d’une couleur rouge brique. Ils sont biréfringents et dichroïques, et leur forme géométrique varie avec leur origine.

Toutes les oxyhémoglobines étudiées jusqu'ici sont solubles dans l’eau. Mais la solubilité est extrêmement variable d’une espèce animale à l’autre Hoppe-Seyler a trouvé que 100 cent. cubes d’eau dissolvent, à5°, 2 gr. d’oxyhémoglobine de chien desséchée à 100,

Les cristaux sont insolubles dans l’alcool. Un contact prolongé avec ce liquide ou même simplement avec de l’eau alcoolisée, diminue considérablement la solubilité des cristaux dans l’eau. Des traces de potasse, d’ammoniaque ou de carbonate de soude augmentent la solubilité et la stabilité des solutions. |

L’oxyhémoglobine ne diffuse pas à travers le papier parchemin, ni vers l'eau, ni vers les acides, ni vers les alcalis.

Les solutions aqueuses d’oxyhémoglobine ont la couleur rouge vif du sang artériel étendu, et les phénomènes spectroscopiques qu’elles présentent, ne les distinguent en rien d’une solution sanguine étendue. Ces réactions sont les mêmes, quelle que soit l’origine de la matière colorante.

Une solution d’oxyhémoglobine un peu concentrée ne laisse passer qu’un spectre pâle limité au rouge et à une partie de l’orangé. Si l’on diminue peu à peu l'épaisseur de la solution ou sa concentration par addition d’eau, le spectre s’éclaire jusqu’en D. La première couleur qui apparaît ensuite est le vert qui devient visible entre E et Ÿ. Une dilution plus grande fait apparaître un peu de jaune verdâtre à peu près à égale distance de Det de E, ce qui divise en deux bandes le large espace obscur qui séparait la première trace du vert du commencement du spectre. En même temps l’obscurité recule de plus en plus du côté du violet. Finalement, le sceptre n’est plus modifié que par la présence de deux bandes d’absorption situées entre E et D; la première, plus étroite, plus obscure, se trouve très près de D; la seconde, à bords moins nets, mais plus large, reste un peu en decà de E.

Une solution de 1 gr. d’oxyhémoglobine dans dix litres d’eau, observée sous une épaisseur de un centimètre, présente encore très nettement ces deux bandes d'absorption. Ces phénomènes seront étudiés d’une manière plus précise à propos de la méthode spectrophotométrique

PROPRIÉTÉS CHIMIQUES. — Les cristaux d’oxyhémoglobine doivent être desséchés à 0°. Ils conservent, dans ce cas, leur couleur rouge brique, claire, et se redissolvent en totalité dans l’eau. L’oxyhémoglobine complètement desséchée à 0°, peut être portée pendant plusieurs heures à une température de 115°, sans éprouver de décomposition sensible. Mais si la dessication n’a pas été complète, les cristaux prennent une couleur brun sale et ne se dissolvent plus en totalité dans l’eau. Pour avoir une solution titrée, il est donc préférable de la faire quelconque, et d’en déterminer le titre par Pévaporation dans la vide, à 0°, d’un volume connu, dont on pèse le résidu desséché à 110°.

Les oxyhémoglobines contiennent de l’eau de cristallisation, probablement en quantité variable, selon leur origine. Des cristaux d’oxyhémoglobine de sang de chien, desséchés dans le vide à 0°, perdent encore de 3 à 4 p. 100 de leur poids, quand on les chauffe à 100°.

Les analyses élémentaires d’oxyhémoglobine portent toutes sur des cristaux desséchés à 0°, puis à 110°. Pendant cette dessication, l’oxygène faiblement combiné se dégage, et on soumet en réalité à l’analyse de l’hémoglobine et non pas l’oxyhémoglobine. Mais si oxygène ainsi mis en liberté, présente un volume appréciable, son poids, par contre, est tout à fait minime. Ainsi, 100 gr. d’oxyhémoglobine ne contiennent guère que 0,24 d'oxygène faiblement combiné. Or, nos solutions normales sont, en moyenne, à 1 gr. p. 100. Leur résidu sec exprime donc aussi exactement leur richesse en hémoglobine qu’en oxyhémoglobine.

Je ne reproduirai pas les tableaux indiquant la composition centésimale des différentes hémoglobines analysées jusqu'ici. Elles contiennent toutes du carbone, de Phydrogène, de l’oxygène (oxygène de constitution, non enlevé par le vide), de Pazote, du soufre, et enfin du fer. Le phosphore indiqué par quelques auteurs provient de la nucléine ou de la lécithine. Un seul chiffre nous intéresse, au point de vue du dosage : c’est celui du fer. Il présente les variations suivantes :

mg). || : res HOMME EL DELA ER LAN 05,42 p. 100 GIHEN DR Me ar 0 ,43 — ORNE ER ARR eee t 0 ,47 — Cochon ins Mer MANAGER 0 ,48 — ÉCHECS NEE ST AREAS 0 ,59 — DICO PND nl n E AN EU 0 ,43 —

Preyer indique pour le sang de chien le chiffre de 05,42. Les tableaux analytiques cités par les auteurs ne donnent pas une idée complète de la composition de l’oxyhémoglobine, puisque la dessication dans le vide a chassé l’oxygène faiblement combiné. En quelle quantité est fixé cet oxygène qui fait partie de la molécule oxyhémoglobine, et dont le facile déplacement constitue le caractère distinctif de ce corps? Cette question sera traitée en détail à propos du dosage de l’hémoglobine par la détermination de loxygène combiné.

Les solutions d’oxyhémoglobine sont très altérables à l’air et à la température ordinaire. Les bords du filtre sur lequela passé la solution se colorent presque aussitôt d’un liseré brun rougeâtre, dû à la formation d’un peu de méthémoglobine. Cette altérabilité de l’oxyhémoglobine empêche la conservation d’une solution titrée au delà d’une huitaine de jours. Nous verrons plus loin, en parlant de l’hémoglobine, comment cette difficulté peut être tournée.

Les solutions d’oxyhémoglobine ont été examinées par Preyer, au point de vue de leur action sur la plupart des corps de la chimie. Voici simplement les caractères de pureté de la solution.

Elle ne doit pas précipiter par le sublimé corrosif, ni par le nitrate d’argent, ni par l’acétate de plomb. Mais ces réactifs, ainsi que la solution, doivent être employés à une température voisine de 0°, sous peine d’obtenir des précipités, même avec des solutions pures. Il ne faut d’ailleurs tenir compte que des précipités qui se forment immédiatement. Evaporée et calcinée, la solution laisse un résidu d'oxyde ferrique pur qui, traité par l’acide azotique, ne doit pas jaunir le molybdate d’ammonium (absence de phosphore). Preyer ajoute que, dans ces conditions, et après plusieurs cristallisations, on peut considérer le produit comme pur.

En présence des acides minéraux ou organiques, même étendus, et à une température modérée, l’oxyhémoglobine se décompose en hématine et en une matière albuminoïde coagulable. On admet, d’après la comparaison des formules, que 100 gr. d’oxyhémoglobine sèche fournissent 4,7 d’hématine. Mais cette donnée n’a pas été vérifiée directement.

Les réducteurs en solution faiblement alcaline ou neutre, tels que le sulfure d’ammonium, le stannite de sodium, transforment l’oxyhémoglobine en hémoglobine. La réaction est souvent assez lente. Avec lhydrosulfite de soude elle est instantanée. Le vide aidé de la chaleur, ou un courant d’un gaz inerte longtemps prolongé, produisent le même effet.

$ I. — Hémoglobine.

ÉTAT NATUREL ET PRÉPARATION. — L’hémoglobine se rencontre dans le globule du sang veineux, à côté de l’oxyhémoglobine. On ne peut l’extraire directement du sang, ni la conserver autrement qu’à l’abri de Pair. L’oxygène, en effet, la transforme très rapidement en oxyhémoglobine.

Pour la préparer, on part de l’oxyhémoglobine que l’on réduit soit par le vide, soit par un courant d’hydrogène, ou tout simplement en l’abandonnant dans un tube scellé avec petit volume d’air.

PROPRIÉTÉS PHYSIQUES. — D’après Hoppe Seyler, lhémoglobine est incapable de cristalliser, et ses solutions évaporées dans le vide ne laissent que des résidus amorphes. Hüfner à vu, au contraire, le sang putréfé en vase clos abandonner souvent des cristaux d’hémoglobine.

Les solutions d’hémoglobine sont dichroïques, plus foncées que les solutions d’oxyhémoglobine. Leur aspect est celui du sang veineux.

Cette substance en solution concentrée absorbe tout le spectre, sauf le rouge. La dilution fait successivement apparaître le vert, et reculer lobscurité du côté du violet. Mais entre le vert et le rouge, persiste une large bande d'absorption à bords lavés, dont le milieu se trouve à égale distance des deux bandes de Poxyhémoglobine, mais qui disparaît plus rapidement que celles-ci par la dilution. Cette circonstance permet de reconnaître au spectroscope la présence simultanée des deux corps.

PROPRIÉTÉS CHIMIQUES. — L'action des réactifs ne peut être étudiée qu’a abri de l’air et avec des dispositifs spéciaux.

Si on porte à 100° en l'absence de l’air, une solution d’hémoglobine, elle se dédouble en une matière albuminoïde coagulable et en hémochromogène. S’il est resté de l'air, la décomposition va d'emblée jusqu’à l’hématine.

Les acides et les alcalis opèrent très rapidement cette décomposition. Mais en présence d’un acide, l’hémochromogène abandonne son fer à l’état de sel ferreux, et donne naissance à de l’hématoporphyrine (1). Ces réactionsmontrent la différence capitale qui existe entre les deux matières colorantes du sang. Le petit tableau suivant résume ces réactions :

Oxyhémoglobine se dé- | 1° Matière albuminoïde. compose en présence des acides en : | 2° Hématine.

1° Matière albuminoïde.

2° Hémochromogène qui, au contact de l’air, se transforme rapidement en hématine.

Hémoglobine se décompose à l’abri de l'air, en présence des alcalis, en :

Ces expériences montrent de plus que c’est le noyau coloré, l’hémochromogène, qui fixe l’oxygène faiblement combiné; il est probable que ce noyau coloré est le même dans toutes les hémoglobines. La quantité d'oxygène fixée est-elle la même aussi ? C’est ce qui reste à démontrer.

Les réactions précédentes nous présentent l’hémoglobine comme une substance facilement décomposable. Et cependant, dans d’autres conditions, elle montre une remarquable stabilité, et sa résistance à la putréfaction est pour ainsi dire illimitée.

Hoppe-Seyler a fait, à ce sujet, les expériences les plus concluantes et de la plus haute importance au point de vue de la conservation des solutions

titrées.

Lorsqu'on enferme dans des tubes scellés, avec ou sans corps en putré-

(4) C'est à un semblable produit qu’avaient à faire probablement MM. Paquelin et Jolly, quand ils ont soutenu que la matière colorante du sang ne contient pas de fer.

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faction, une solution aqueuse d’oxyhémoglobine, et qu’on abandonne le tout à la température ordinaire, on voit la solution prendre une teinte veineuse dans des limites de temps variables. Si l’on retourne le tube, et si l’on examine au spectroscope le liquide qui s’écoule le long des parois, on voit que les raies de l’oxyhémoglobine ont été remplacées par la bande unique de l’hémoglobine. A partir de ce moment les phénomènes spectroscopiques restent les mêmes pendant plusieurs années.

Des solutions d’oxyhémoglobine pure peuvent se conserver intactes à l’état d’hémoglobine, si on empêche tout accès de l’air. Citons ici une des expériences de Hoppe-Seyler: Une solution d’oxyhémoglobine de chien pure est enfermée dans des tubes scellés. Au bout d’un an, le titre, qui était 35,884 p- 100, est tombé à 35,823. L’examen spectroscopique ne révèle la présence d’aucun produit de décomposition. Il faut donc admettre que la putréfaction a débarrassé l’oxyhémoglobine d’impuretés inévitables. De là le léger abaissement du titre.

Si l’on abandonne à l’air, dans un vase cylindrique, une solution de sang, le spectroscope montre, au bout de peu de temps, que le liquide ne contient plus d’oxyhémoglobine, excepté à la surface, dans une couche de quelques millimètres. En effet, l'oxygène absorbé au contact de l’air est incessamment employé à des phénomènes de putréfaction, phénomènes assez rapides pour limiter l’oxydation de la matière colorante, et la confiner dans une mince couche à la surface du liquide. Si on refroidit la solution, ou si on y ajoute de l’alcool, le processus putride est ralenti, et la couche contenant de l’oxyhémoglobine descend plus en avant dans le liquide.

Ces expériences nous expliquent commentilse fait que du sang abandonné à lui-même en été et à l’air libre, conserve sa capacité respiratoire qui est fonction, comme on le verra, de sa richesse en hémoglobine.

En second lieu, elles nous fournissent un moyen de conserver les solutions d’oxyhémoglobine. Il suffit de les enfermer, ainsi que le propose Hoppe- Seyler, dans des tubes scellés avec aussi peu d’air que possible. L’oxyhémoglobine si altérable est rapidement transformée en hémoglobine imputrescible. Au moment des besoins, on ouvre le tube, on dilue convenablement la solution, et on détermine son titre par évaporation.Ces manœuvres suffisent amplement pour oxyder toute l’hémoglobine.

IDENTITÉ DES DIFFÉRENTES HÉMOGLOBINES. — Hoppe-Seyler semble peu disposé à admettre cette identité. II met surtout en lumière les différences profondes dans la solubilité. Rollet n’accorde à cet argument qu’une valeur secondaire. Selon lui, cette question des solubilités est entièrement à revoir. Des déterminations comparatives faites sur des substances pures et dans des conditions identiques manquent d’ailleurs totalement. Les différences dans la composition centésimale n’auraient pas plus de valeur, la matière analysée n’étant jamais complètement pure. Ainsi l’odeur propre à chaque sang subsiste malgré des cristallisations répétées.

Au contraire, identité des phénomènes spectroscopiques est un argument d’une grande valeur en faveur de l’identité des hémoglobines. On a vu plus haut que l’hémoglobine se compose d’un noyau de nature albuminoïde sur lequel se greffe un autre noyau coloré. Des mesures spectrophotométriques (1) très nombreuses ont amené Hüfner à l'hypothèse suivante : selon lui, il est très probable que si les hémoglobines diffèrent les unes des autres, c’est par le noyau albuminoïde. Le noyau coloré, celui dont dépend l’absorption lumineuse, reste probablement le même. Cette hypothèse n’est pas fondée seulement sur une simple inspection du spectre des différentes espèces de sang, mais sur des mesures spectrophotométriques exactes dont le résultat peut se formuler ainsi : le quotient des rapports d'absorption dans deux régions spectrales données, ne varie pas sensiblement d’une espèce animale à autre:

Nous reviendrons en détail sur cette question si intéressante dans le chapitre consacré à la méthode spectrophotométrique.

DE QUELQUES MATIÈRES COLORANTES ANORMALES. — Je tiens à ajouter quelques mots relatifs à un produit de substitution de Poxyhémoglobine, l’'hémoglobine oxycarbonique, et à un produit de décomposition, la méthémoglobine. Comme il sera question de ces deux composés dans le courant de ce travail, il n’est pas inutile de rappeler ici les points saillants de leur histoire.

L’hémoglobine oxycarbonique prend naissance par substitution à volumes égaux de l’oxyde de carbone à l’oxygène faiblement combiné de l’oxyhémo-

(4) Voir chapitre II.

globine. Ce composé présente les mêmes formes cristallines que loxyhémoglobine correspondante, et au spectroscope les mêmes bandes dabsorption entre Det E, mais légèrement reportées vers E. Sous l'influence des agents réducteurs, ces deux bandes persistent. En vase clos, la conservation de Phémoglobine oxycarbonique est pour ainsi dire indéfinie.

Tous les corps oxydants transforment l’oxyhémoglobine en mélhémoglobine. Toutefois si le milieu est acide, la décomposition va jusqu’à lhématine.

D’après Hoppe-Seyler, la méthémoglobine ne serait pas un peroxyde de l’hémoglobine, encore moins un mélange d’hématine et de matière albuminoïde, comme on l’a prétendu. Elle contient au contraire moins d’oxygène que l’oxyhémoglobine, maïs plus que l’hémoglobine. Cet oxygène n’est pas faiblement combiné et ne se dégage pas dans le vide.

Les réducteurs en solution neutre ou faiblement alcaline transforment la méthémoglobine en hémoglobine qui, au contact de l'air, reproduit l’oxyhémoglobine.

Au spectroscope, ce composé est caractérisé par une bande d’absorption en plein rouge entre C et D. Cette bande se distingue facilement de celle de Phématine. Les alcalis la font disparaître rapidement; lesréducteurs neutres ou alcalins produisent aussi cet effet, en même temps qu’ils font apparaître la bande de l’hémoglobine.