CHAPITRE I MÉTHODES CHIMIQUES

Les méthodes chimiques consistent en général à doser soit un produit de décomposition de la matière colorante, soit un des principes qui entrent dans sa composition.

J’exposerai successivement le dosage de l’hémoglobine par le fer, par l’hématine, et par la quantité maxima d’oxygène absorbé.

Le procédé décolorimétriquede M. Quinquaud, fondésur ladestruction de la matière colorante par le chlore, trouve naturellement sa place dans cet expose des procédés chimiques.

. $1. — Dosage del’hémoglobine parle fer.

On admet que l’hémoglobine contient 0,42 p. 100 de fer, proportion constante (?), qui peut être dosée dans les cendres du sang par les procédés ordinaires.

Si l’on désigne par f la quantité de fer déterminée dans les cendres de 100 grammes de sang, le poids d’hémoglobine qui correspond à ce fer sera:

nor

ne Le fee 238,1.

Tel est le principe. Le manuel opératoire proposé par Pelouze est le suivant. On évapore doucement dans une capsule de platine d’un quart de litre de capacité, une quantité pesée de sang, de 100 à 130 gr.

Le résidu est calciné au rouge sombre pendant deux heures, puis épuisé à chaud par 10 c. c. d'acide chlorhydrique étendus de leur poids d’eau. On ajoute ce liquide par portions, que l’on transporte chaque fois à aide d’une pipette sur un petit filtre de Berzélius installé sur un ballon gradué. Chaque épuisement est suivi d’une calcination, et ces opérations sont répétées jusqu’à ce que le charbon ait entièrement disparu. Finalement on calcine le filtre lui-même ; sa cendre est traitée par l’eau acide, et la liqueur claire qui en résulte, est jointe directement à celles qui proviennent des opérations précédentes. Cette solution, étendue à 500 cent. cubes estadditionnée de 10 cent. cubes d’une solution de sulfite de soude à 10 p. 100, puis chauffée et maintenue à l’ébullition pendant trois à quatre minutes. Le liquide refroidi est étendu au litre, et le sel ferreux qu’il contient est dosé à l’aide du permanganate de potasse.

Je n’ai pas suivi dans tous ses détails le procédé qui vient d’être exposé.

J’ai opéré en général sur 100 gr. environ de sang défibriné. L’évaporation se faisait dans l’étuve à eau de Gay-Lussac. Si l’on calcine la masse solide obtenue au bout de quelques heures ou même d’une journée, elle se boursouffle énormément. Il faut chauffer avec une lenteur extrême et réprimer à l’aide d’un couvercle en platine le champignon qui se produit, ou le crever constamment avec la spatule, ce qui expose à des pertes.

Si, au contraire, on abandonne le résidu de l’évaporation à 100° pendant douze ou vingt-quatre heures dans une étuve à air chauffée à 120°, on peut achever très rapidement la carbonisation sans boursoufflement notable de la masse, et porter ensuite dans un fourneau à moufle. Au bout d’une heure le charbon a pour ainsi dire totalement disparu.

Cette première partie de l’opération exige de cette facon un temps assez long, mais ne demande à peu près aucune surveillance de la part de l’opérateur.

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En employant pour l’extraction du fer de 100 gr. de sang, 10 gr. d'acide chlorhydrique étendus de leur poids d’eau, de la manière que Pelouze indique, on n'obtient que très lentement la dissolution de toutle fer. I1Im’estarrivé plus d’une fois de constater que les taches noires qui restent toujours au fond de la capsule, cèdent encore un peu de fer à l’acide chlorhydrique bouillant, comme il est facile de s’en assurer à l’aide du ferrocyanure de potassium. On comprend qu’il puisse facilement en être ainsi, si l’on se rappelle que loxyde ferrique fortement calciné se dissout difficilement dans les acides.

Aussi ai-je préféré employer du coup 20 à 30 cent. cubes d’acide chlorhydrique que je maintiens bouillants pendant un quart d’heure environ, en ajoutant un peu d’eau à mesure que le liquide se concentre. La solution obtenue est transportée sur le filtre à l’aide de la pipette ; on calcine fortement pendant quelques instants, puis on recommence l’épuisement avec la même quantité d’acide. On arrive ainsi beaucoup plus rapidement à un liquide dans lequel le ferrocyanure ne décèle plus trace de fer.

La solution obtenue est jaune et parfaitement limpide. Elle contient le fer à l’état de sel ferrique. Le dosage exige que ce métal soit à l’état de sel ferreux. La réduction préalable du liquide peut se faire à l’aide du zinc ou du sulfite de soude. L’un et l’autre doivent être, bien entendu, exempts de fer.

Pour cela, on fixe äu bout d’un fil de platine deux ou trois bâtons de zinc, et on les introduit dans la solution à réduire. Quand on juge que le dégagement d'hydrogène a duré assez longtemps, on retire le zinc à l’aide du fil de platine, et on le lave soigneusement à l’eau distillée.

Ce procédé présente plusieurs inconvénients. La réduction n’est pas ins- tantanée comme avec le sulfite de soude. De plus, il se détache parfois de nombreuses parcelles de zinc qu’il faut nécessairement achever de dissoudre, ce qui est souvent fort long.

Si l’on emploie le sulfite de soude, il importe de bien chasser tout lacide sulfureux. Dans le procédé de Pelouze, on ajoute ] gr. de sulfite à un demilitre de liquide contenant 10 gr. d’acide chlorhydrique. La liqueur est donc peu acide, et j'ai constaté, à l’aide d’un papier iodaté placé à orifice de la fiole, qu’un quart d'heure d’ébullition ne suffit pas toujours pour chasser tout l'acide sulfureux. De là la tentation d’ajouter encore de l’acide chlorhydrique, afin de mieux déplacer le gaz sulfureux.

op

Mais Frésénius a démontré que le dosage du fer par le permanganate n’est exact qu’en solution sulfurique. En présence de lacide chlorhydrique, il se forme du chlore, dont l’action décolorante s’ajoute à celle du chlorure ferreux. Le dosage n’est possible qu’en présence d’une petite quantité d'acide chlorhydrique fortement diluée.

Finalement, voici comment j'ai opéré : on prépare une solution de permanganate assez étendue, et telle qu’il en faille environ 30 cent. cubes pour peroxyder 05,01 de fer. La solution chlorhydrique des cendres est étendue à 250 cent. cubes. On en distrait 50 ou 100 cent. cubes qu’on introduit dans une grande fiole à fond plat. On ajoute 100 à 150 cent. cubes d’eau et 10 cent. cubes de la solution de sulfite. On chauffe pendant quelques instants, puis on ajoute 5 cent. cubes d’acide sulfurique concentré. En maintenant le liquide pendant trois ou quatre minutes à 100°, on est sûr de déplacer la majeure partie de l’acide chlorhydrique et tout l’acide sulfureux.

La liqueur refroidie est étendue à 250 cent. cubes environ et on procède au dosage en ayant soin de placer la fiole sur un fond blanc. Il ne faut pas oublier que la coloration rose finale ne persiste jamais au delà de quelques minutes.

La solution de permanganate s’altère assez rapidement. Il faut donc la titrer avant chaque série de dosage, à l’aide d’une solution titrée de fer ou d'acide oxalique.

J’ai employé simultanément les deux procédés. En titrant à l’aide de Pacide oxalique une solution contenant une quantité pesée de fer, j’ai trouvé successivement :

quantité pesée de fer........ CR RTE Os",01 — dosée par l’acide oxalique.......... 0 ,01032 — —— ’ 0 ,009996 Æ 0 ,010014

Le procédé que je viens d’exposer suppose que tout le fer du sang provient de l’hémoglobine, ce qui n’est pas démontré. La présence de petites quantités de fer dans l’urine prouve qu’il doit en exister un peu dans le

M, un

sérum. Boussingault, qui a étudié la répartition du fer dans les matériaux du sang, a trouvé que 100 gr. de matière sèche contiennent :

HDLIRER Rs PAL 0",046 de fer.

DIOPUlE SERA 0,35 SÉPUM SEC UNIENL: 0 ,086

Or, 100 gr. de sang contiennent au maximum 05,4 de fibrine qui fourniraient par suite 0f,00019 de fer, et 7 à 8 p. 100 d’albumine du sérum qui contiendrait 05,004 de fer. Il faut ajouter que le sérum analysé ainsi que la fibrine étaient colorés en rouge. Le fer qu’ils contenaient, provenait donc probablement d’impuretés d’hémoglobine. On peut donc, jusqu’à plus ample informé, rapporter à la matière colorante tout le fer que contient le sang.

On admet de plus que toutes les hémoglobines, et en particulier celle du sang humain, contiennent la même proportion de fer, 0%,42 pour cent. Les chiffres cités au commencement de ce travail montrent qu’il n’en est rien. Hoppe-Seyler indique, par exemple, 0,43 p. 100 de fer dans l’hémoglobine du chien, Preyer en a trouvé, au contraire, chez le même animal 0f",42, et Kossel, chez le cheval, 0f,47. Si on transforme en hémoglobine les cinq centigrammes de fer que contiennent en moyennne 100 gr. de sang, en prenant successivement pour point de départ du calcul les trois chiffres 0%,42 — 0,43 — 05,47, on trouve les quantités d’hémoglobine suivantes :

Les auteurs ont adopté indifféremment pour toutes les espèces animales le coefficient 0,42, Le calcul précédent montre que l’erreur que lon peut commettre ainsi est loin d’être négligeable. Elle serait dans l’exemple que jai choisi de 14,30 pour 100 gr. de sang de cheval.

Mais le plus grand inconvénient du procédé résulte de la faible quantité de fer que contient Phémoglobine et qui fait que les erreurs sont multipliées par le facteur 238.

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Le plus fort écart que présentent les dosages de Pelouze est de 0f',0014 pour 100 gr. de sang, ce qui correspond à 05,33 d’hémoglobine. J'ai fait à plusieurs reprises deux dosages de fer dans le même sang, en opérant chaque fois sur 100 et sur 50 gr. de matière. La solution ferreuse obtenue était diluée à 250 cent. cubes; en opérant sur 100 ou 50 cent. cubes de ce liquide, on pouvait faire avec le permanganate deux ou trois dosages successifs. Exemple :

1°/ Sang de bœuf.

Poids du sang soumis à la calcination, 108:",88.

La solution des cendres est étendue à 250 cent. cubes; 50 cent. cubes de cette liqueur exigent successivement 27%,7 — 27%,9 — 27%,5 de permanganate, ce qui correspond aux chiffres suivants de fer et d’hémoglobine dans 100 gr. de sang.

27%,7 de permanganate, 05',0473 de fer — 114,26 d’hémoglobine p. 100. 215,9 — 05,0476 — — 115,33 »

2°/ Le même sang de bœuf.

Poids du sang soumis à la calcination, 47%",14.

La solution des cendres est étendue à 250 cent. cubes ; 100 cent. cubes de cette liqueur exigent :

23,6 de permang. — 0%,0465 de fer p. 100, 115,07 d’hémogl. p. 100. 232,5 — — 0:",0463 — 11202 —

On voit que l’écart maximum est de 0%,81 d’hémoglobine pour 100 gr. de sang.

Ce procédé a le très grave inconvénient d’exiger une trop grande quantité de sang, 50 à 100 gr.; il nécessite des manipulations chimiques longues et délicates, et la préparation de liqueurs titrées spéciales. Il constitue plutôt un contrôle utile des autres procédés de dosages.

Je n’indiquerai pas ici les résultats que j’ai obtenus. Ils seront donnés sous

forme de tableau en même temps que les chiffres fournis par les autres procédés.

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$ II. — Dosage de l’hémoglobine par la quantité

d’'hématine formée.

Ce procédé consiste à transformer l’hémoglobine en hématine qui est lavée, séchée et pesée.

On admet, d’après les quantités de fer que contiennent les deux corps, que 1 gr. d’hématine correspond à 21f,31 d’hémoglobine.

L’extraction de lhématine est très longue. Elle serait, de plus, toujours incomplète, d’après Rajewski.

Le procédé exige une trop grande quantité de sang, pour qu’il soit applicable en clinique ou même dans des recherches physiologiques.

On sait combien est difficile la préparation de l’hématine pure. Selon le mode de préparation employé, les produits obtenus diffèrent dans leurs propriétés.

Ce procédé de dosage, qui à été remis en honneur dans ces derniers temps par Brozeit, me semble donc peu pratique et probablement infidèle.

$ III. — Dosage de l’hémoglobine par l'oxygène

absorbé.

. GÉNÉRALITÉS. — L’hémoglobine forme, avec l’oxygène, une combinaison cristallisée, chimiquement définie, qui est l’oxyhémoglobine.

Hoppe-Seyler a montré que des cristaux humides d’oxyhémoglobine, aussi bien que leur solution aqueuse, dégagent de l’oxygène sous Paction du vide.

D’autre part, M. Fernet, en agitant du sang au contact de l'oxygène, sous des pressions variables, est arrivé à cette double conclusion : 1° qu’il se dissout dans le plasma sanguin une quantité d’oxygène à peu près égale à celle qui se dissout dans l’eau pure ; 2° que les globules sanguins fixent chimi-

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quement une quantité d'oxygène indépendante de la pression et bien supérieure à la première.

Il semble donc bien prouvé actuellement que l’hémoglobine, aussi bien en solution que dans le globule, forme avec l’oxygène une combinaison chimiquement bien définie.

L’oxygène dégagé, sous l’action du vide par exemple, a donc fait partie de la molécule oxyhémoglobine. Il en résulte que ce gaz doit se trouver dans un rapport constant avec le poids de matière colorante qui l’a fourni, ou le poids d’un des éléments — fer, par exemple — de cette substance.

En d’autres termes, la richesse en hémoglobine est dans un rapport constant avec le plus grand volume d’oxygène absorbé par le sang, ou avec sa capacité respiratoire.

Ce rapport constant une fois établi, tout procédé de dosage de l’oxygène dans le sang pourra servir à la détermination de l’hémoglobine.

Plusieurs questions se posent ici. Dans quelles limites la quantité maxima d'oxygène fixée par l’hémoglobine, est-elle indépendante de la pression à laquelle se fait la saturation du sang ? Et en second lieu, dans quelles proportions l’oxygène simplement dissous dans le sérum vient-il s’ajouter à Poxygène combiné qui, seul, devrait être dosé? J. Worm Muller (1), et après lui Hüfner (2), ont établi que l’oxyhémoglobine, bien saturée d'oxygène, ne commence à se dissocier que lorsque la pression d’oxygène que Supporte la solution, tombe au-dessous de 20 millim. de mercure.

P. Bert (3), en agitant du sang avec de l’air, à des pressions croissantes qui ont été poussées jusqu’à 18 atmosphères, a vu la capacité respiratoire augmenter avec la pression. Mais l'augmentation suivait chaque fois la loi de Dalton. On peut en conclure que l’oxygène dissous physiquement, est seul dépendant de la pression.

L'état particulier et inconnu dans lequel se trouve l’hémoglobine dans le globule sanguin, n’infilue pas sur la quantité maxima d’oxygène fixée. La capacité respiratoire d’un sang frais reste la même après destruction des

(4) Ber. d. saechs., Acad. d. Vissensch., 1870. (2) Zeitsch. [. physiol. Chemie, Bd VI, 1 Heft 1882. (3) P. Bert, La pression barométrique, p. 697, Paris, 1878.

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globules par la putréfaction et dissolution de la matière colorante dans le plasma.

Les variations de température et de pression n’influent donc que sur la quantité d'oxygène physiquement dissoute. Les chiffres fournis par M. Fernet permettent de calculer que 100 cent. cub. de sang dissolvent physiquement à 16°, 0®,57 d'oxygène (1). D’après une série de déterminations très exactes faites par Hüfner, sur un sérum de densité moyenne 1,012, 100 cent. cubes de sérum ne dissolvent que 0,38 d'oxygène à 16°. A l’oxygène chimiquement combiné variable avec la quantité d’hémoglobine, s’ajoute donc une quantité à peu près constante de gaz, dissoute physiquement et toujours assez faible pour qu’il soit permis d’en faire abstraction.

Mais on ne pourra pas négliger cette cause d'erreur, si on opère la saturation du sang dans une atmosphère d’oxygène pur. La pression de ce gaz devenant cinq fois plus forte que dans l’air, la quantité qui s’en dissout dans le plasma est multipliée par ce chiffre et cesse d’être négligeable. En agitant, au contraire, le sang à l’air et à la température ordinaire, la saturation de l’hémoglobine est tout aussi complète. On a, de plus, avantage de se servir d’un milieu gazeux dont la composition est constante, qui ne nécessite aucune préparation, et dont la pression peut, au besoin, être connue à chaque instant sans aucune installation spéciale.

Le dosage de l’hémoglobine par détermination de la capacité respiratoire, exige évidemment la solution préalable de la question suivante : Quelle est la quantité d'oxygène que peut fixer 1 gr. d’hémoglobine?

Ce chiffre peut être établi par des considérations théoriques empruntées à Hoppe-Seyler.

Si on admet qu'à un atome de fer dans l’hémoglobine, correspond un atome d'oxygène, le rapport constant qui doit & priori exister entre ces deux éléments, sera :

(ROURO TO hé. 02857

(1) Tous les volumes gazeux cités dans ce travail sont ramenés à la température de 09 et à la pression de 0,760, sauf indication contraire,

SÉPOGNEEE

Si 100 gr. d’hémoglobine contiennent 05,42 de fer, la quantité théorique d'oxygène fixée sera 0,42 >< 0,2857 ou 0%,12 d’oxygène, ce qui fait 83°,69 pour 100 gr. d’hémoglobine.

On verra plus loin que ce chiffre est inférieur à ceux qui ont été trouvés par l’expérience directe. Si donc on ne veut pas admettre de rapport compliqué entre l'oxygène et l’hémoglobine, on peut supposer qu’à un atome de fer correspondent deux atomes d’oxygène, ce qui donne, par un calcul analogue au précédent, 05,24 ou 167,38 d’oxygène pour 100 gr. d’hémoglobine.

Hoppe-Seyler (1) le premier, a cherché à vérifier ces vues théoriques par Pexpérience directe, en soumettant à l’action du vide des cristaux ou des solutions d’hémoglobine.

Il a trouvé ainsi, pour 1 gr. d’hémoglobine sèche en solution dans de l’eau, 1,68 d'oxygène. Des cristaux bien exprimés entre des feuilles de papier, ont fourni 0*,68, enfin des cristaux complètement secs, 0,52 pour 1gr. de matière colorante sèche. )

Dybkowski (2) dose l’oxygène absorbé par des solutions d’hémoglobine de concentration connue, à l’aide du procédé de Claude Bernard. Il était tenu compte chaque fois de la quantité d’oxygène physiquement dissoute, en admettant que l’eau s’était saturée d’oxygène, et qu’il n’en passait dans Patmosphère d’oxyde de carbone que la quantité nécessaire pour qu’il y eut équilibre de pression entre le gaz diffusé et celui qui restait en solution. Dybkowski a trouvé ainsi 1*,56 pour 1 gr. d’hémoglobine sèche.

Preyer (3) essaya de résoudre la question par voie absorptiométrique. Il introduisit dans des tubes gradués remplis de mercure, des solutions d’hémoglobine complètement réduites et de concentration connue, qui furent agitées avec des volumes préalablement mesurés d'oxygène. Les quantités de gaz absorbées furent pour 1 gr. de matière sèche, 1,80 — 1,72 —

Enfin, les déterminations les plus exactes sont dues à Hüfner, qui a fait

(1) Med. chem. Uutersuch., Heft IT, p. 191, 1868. (2) Jbid., Heft I, p. 117, 1866.

(3) De hæmoglobino observationes et cxperimenta, Diss. Bonn., 1866, p. 19.

Dies.

sur ce sujet une série de travaux remarquables par leur rigueur scientifique. |

Cet auteur (1) avait d’abord fait choix d’une méthode mixte, qui consistait à agiter avec de loxyde de carhone une solution sanguine de richesse connue en hémoglobine, et préalablement saturée d'oxygène par agitation à Pair. L’action chimique de l’oxyde de carbone était ensuite aidée du vide. Il déterminait, d'autre part, quelle était la quantité d’oxygène dissoute dans les mêmes conditions, par un sérum de densité sensiblement égale à celle du liquide sanguin. Le chiffre final, corrigé à l’aide de cette donnée, fut 1%,52, moyenne de dix déterminations.

La richesse en hémoglobine des liquides employés, était appréciée à Paide du spectrophotomètre. Une détermination plus exacte de la constante d'absorption de l’oxyhémoglobine, porta ce chiffre de 1,52 à 1%,59, puis à 1%,74. |

Dans un travail récent (2), Hüfner a repris la question en procédant cette fois par voie absorptiométrique.

Des solutions sanguines, dont la richesse en hémoglobine est déterminée au spectrophotomètre, sont complètement réduites par un courant d’hydrogène, puis par l’action du vide. Les solutions introduites dans un absorptiomètre de forme spéciale, sont agitées sous des pressions variables avec des volumes connus d’oxyde de carbone dans une série d’essais, d’oxygène pur dans une seconde série.

Hüfner partait de l’équation suivante :

K=ah+Dp.

dans laquelle K désigne le volume gazeux (ramené à 0° et 1”) absorhé par la solution sanguine, 2 la quantité d’hémoglobine en grammes contenue dans le liquide, » la pression sous laquelle se faisait chaque fois l'absorption, enfin & et à sont deux constantes qui désignent, l’uné 4, le volume d’oxygène

(1) Zeitsch. f. phys. Chemie. Bd. 1, 1877.

(2) Journal f. prakt. Chemie, t. XXII, p. 362, 1880.

or

fixé par l’unité de poids d’hémoglobine, l’autre D, le volume gazeux, variable avec la pression, que dissout chaque fois le liquide.

La température étant maintenue aussi constante que possible, on fait varier la pression, et on mesure chaque fois K..

L'appareil employé est un absorptiomètre de Wiedemann légèrement modifié. L’absorption d’une partie du gaz par la solution détermine une diminution de pression, qui à pour effet de faire couler du manomètre dans le récipient à liquide une certaine quantité de mercure. C’est cette quantité de mercure qui sert à mesurer le volume gazeux disparu.

Hüfner a fait une série de dix essais, dont trois avecl’oxyde de carbone, et sept avec l’oxygène ; les valeurs de Æ et p observées chaque fois fournissent une série d'équations qui, convenablement combinées, donnent la formule d'absorption suivante :

La grandeur cherchée est donc :

1202 M SUR ME à 0° et 1” de pression.

TOUS DE CPP EEE PRE RP ENTRE à 0°et 0,760 — .

Voici, sous forme de tableau, les résultats les plus comparables obtenus jusqu'ici. J’indique en même temps, dans une deuxième colonne, le chiffre que l’on obtient en transformant 20 cent. cubes d’oxygène en hémoglobine, à l’aide de chacune des valeurs de la constante cherchée.

1° Par voie absorptiométrique :

Preyer 17,80 1 ED TE — 112 1162:

Hüfner 1,58 12,165.

mes 99

2° Par épuisement à l’aide du vide ou déplacement par l’oxyde carbone :

Hoppe-Seyler 1E:08 112,90.

Dybkowski 1,56 12782 Hüfner 1,74 11, 49.

3° Quantité théorique :