I. — Objets et jiéiuodes D’ÈnroE

Objets (F étude. — Les recberebes que j’exposerai dans ce mémoire ont été faites surtout sur des embryons de mammifères, vache, chien, rat, lapin, cobaye, et principalement sur ceux du mouton, qu’on se j)rocure facilement à tous les états de développement dans les abattoirs de Paris.

ÉLÉMENTS DE LA MOELLE

.l’ai également étudié quelques eml)ryons humains, grâce au gracieux concours des internes qui fréquentaient le laboratoire d’histologie du Collège de France, pendant les années 1883 et 1884; mais je dois des remerciements spéciaux à M. Jlabinski, qui s’est donné heaiiconp de mal pour me procurer aussi fraîches que possible toute une série de moelles d’embryons humains ; enlin, cette année,, j’ai eu à la Clinique d’accouchement toute une série de fœtus, sur lesquels j’ai vérifié et constaté mes anciennes recherches.

Mais les embryons humains, sauf ceux d’un développement assez avancé, ne m’ont pas donné de très bons résul- , tats, car en général, avant d’ètre expulsés, ils avaient macéré dan^^l’jLLtérus un temps assez long.

.l’ai aussi étudié le développement de la moelle dans uno^ espèce de squalide ovovivipare, l’aiguillat [Acm\tJnas vitlffarü), qu’on se procure en grande abondance sur les cotes nord de la Bretagne; enfin j’ai examiné, ayant surtout en ^ vueles travaux de F. Boll, la moelle des embryons du poulet.

Mais les observations faites sur les embryons de squale et de poule ne me serviront que pour essayer d’éclaircir quelques points douteux; car dans cette publication, je n’exposerai que les recherches que j’ai faites sur les embryons de mammifères; les embryons du lapin m’ont servi pour l’étude des tous premiers stades du développement, et jirincipalement pour celle des phénomènes intimes de la multiplication cellulaire; ceux du mouton, qu'on obtient facilement et en grand nombre à Paris, m’ont servi surtout pour l’eiisemble do cette étude, car le type du développement des embryons de- L’.c^jècc ovine me paraît être presque semblable à celui des embryons humains, tandis que celui du lapin me semble s’en éloigner beaucoup et se rapprocher du type qu’on observe chez les oiseaux et les plagiostomes. EnfiiFje signalerai, toutes les fois (jiieje le pourrai, ce que j’aurai observé chez le fœtus humain, et pour les derniers stades du développement, je décrirai parallèlement ce que j’ai vu dans l’espèce humaine et l’espèce ovine (1).

(1) Je profite de l’occasion qui m'est olîerte ici pour remercier ÎM. (le- Lacase-Duthiers d’avoir Lieu voulu mettre à ma disposition le persouuel

SYSTÈME NEliVEUX CÉRÉBRO-SIMNAL.

MéthodcsF — Au début de cette reclierclie, j’avais pensé que l’acide osmique, dont les propriétés fixatrices sont si connues, me rendrait de grands services pour l’étude d’éléments aussi délicats que ceux qui composent la moelle embryonnaire; mais je ne fus pas long à reconnaître mon erreur, car cet agent, s’il iixe les éléments d’une façon admirable dans leur forme, leur donne en même temps, surtout lorsqu’il agit sur des cellules embryonnaires, une si g-rande bomogénéité qu’ils se confondent les uns avec les autres. Ce réactif, employé à la manière ordinaire, c’est-àdire en plongeant pendant quelques heures de petits fragments du tissu dans une solution à 4 pour cent de cet acide, a aussi l’inconvénient d’empêcher d’une manière presque absolue la coloration des noyaux par le carmin.

Aussi ai-je dii renoncer à l’employer ainsi, et après divers essais infructueux, je me suis arrêté au procédé suivant, dont les premières indications ont été données par M. Ranvier, à propos du système nerveux de la cloison du cœur de la grenouille (1), et dont je connaissais l’excellence pour l’avoir beaucoup employé dans les recherches que j’ai faites sur le système ganglionnaire du cœur des vertébrés (2 ). Le procédé dont j’ai fait usage consiste à diviser la moelle en petits tronçons mesurant entre 4 et 6 millimètres, et à les plonger pendant une heure ou deux, suivant leur volume, dans un mélange formé de parties égales d’alcool à 90" et d’acide osmique à 1 pour lÜO. Si l’embryou est petit, c’est-à-dire s’il mesure moins de 10 centimètres, il est plus simple de détacher la colonne vertébrale en entier, d’enlever autant que possible les muscles, de la diviser en petits fragments et de plonger le tout dans ce mélange.

Enlin, si l’embryon mesure seulement quelques millimètres, au lieu de le diviser, il est préférable de le mettre en entier dans le mélange d’acide osmique et d’alcool.

Lorsque les fragments de moelle ou les embryons entiers

et le matériel de son laboratoire de UoscolV, pendant les trois mois que j’y ai passés, en ISS."!, à étudier le dévelo])pement de la moelle chez les embryons de l’aiguillat.

(I ) Ranvier, Leçons d’anatomie fjénéralc. Appareils terminaux des muscles de la vie orf/a7iir/ue. Paris, 1880, p. 70.

(?) Ai'c/iives de physiologie normale et pathologique ^ 1881, p. 094.

ÉLÉMENTS DE LA MOELLE. i-5

ont été fixés par ce mélange, on les laisse pendant cjnelques d heures dans de l’alcool à 80“, pour que la réduction de l’acide osmiqne se continue; on les lave ensuite jiendant (jiielques inslants dans l’eau pour enlever l’alcool, puis on les colore en masse en les plaçant pendant 48 heures dans

une solution de picro-carminate d’ammoniaque à 1 pour 100

ou bien dans l’hématoxyline.

Au sortir de la matière colorante, on les lave de nouveau à l’eau, puis on achève de les durcir par 1 alcool, en employant d’abord de l’alcool à 80°, puis à 00°, et enfin de l’alcool absolu.

On peut alors, sans leur faire subir d’autres préparations, couper les fragments de la moelle ou les embryons, mais il est préférable de les inliltrer et de les inclure suivant les procédés connus, soit dans la gomme, soit dans laparatline, mais il vaut mieux encore employer- la-xelloïdioiî qaiÊ Scbilîerdeckcr a substituée au collodion, qui. a été introduit en histologie ilj,. comme substance à inclure et à inliltrer, par Ilonneguy (2) et.M, J3uval (3).

La celloïdine présente, en effet, sur toutes les autres masses qu’on a proposées, le grand avantage d’exiger des manipulations très simples et de pouvoir, dans la majorité des cas, être conservée dans l’intérieur de la pièce, sans présenter le moindre inconvénient. Car il suffit, après avoir fait passer la pièce par l’alcool absolu, de la mettre, pendant 24 heures, dans une solution sirupeuse de celloïdine, puis de la laisser séjourner, après l’avoir fixée sur un fragment de moelle de sureau, pendant 12 heures ou plus, dans de l’alcool à 86°, pour pouvoir en faire des coupes avec la plus grande facilité.

Comme la celloïdine, grâce à sa transparence et son homogénéité parfaite, ne gêne en rien l’observation, on charge les coupes de suite sur la lamelle et on ajoute une goutte

(1) Schitîerdccker, Uelicr die Verwendmig des Cclloidins iii der aiiatoiiiischen Teclmik {Arch. f. Anaf. undEntwickelunfjsgeschichte, 1882, p. l'.)‘,l).

(2) Heimcguy, Société philomatique^ novembre 1878.

1^3) M. Duval, Sur l’emploi du collodion humide {Journal de ra?iat. et de la pfnjsioL, t. XV, 1879, p. 185).

La colloïdine dont je me suis servi venait de Schering. Pour s’en servir, il suffit de la faire dissoudre dans un mélange à parties égales d’alcool a])solu et d’éther; elle doit avoir la consistance d’un sirop épais.

SYSTl'^ME NERVEUX CÉliÉBRO-SPlNAL.

(le glycérine, si on venl les monter dans ce réactif. Lorsqu’on désire conserver les coupes dans le baume du Canada on la résine Damar, il faut, après les avoir placées sur une lame, les traiter par quelques gouttes d’alcool absolu et les .éclaircir par l’essence de bergamole, qui présente sur l’huile de girolle l’avantage de ne pas dissoudre la celloïdine.

La celloïdine a sur la gomme le grand avaniage de ne [>as nécessiter le passage par l’eau de la coupe; car, durant cette opération, des coupes aussi friables que celles des tissus embryonnaires se désagrègent toujours plus ou moins.

Si, pour une raison ou une autre, on désire se débarrasser de la celloïdine, il suffit, lorsque la coupe est déjà chargée sur la lamelle, de faire tomber sur elle une goutte ou deux d’un mélange à parties égales d’alcool et d’étber.

Le mélange d’acide osmique et d’alcool donne de bons résultats, jusqu’à ce que les embryons de mouton aient une longueur de 25 centimètres, ceux de bœuf une de 30, et enfin que l’embryon humain soit âgé de 5 mois. Comme nous le verrons plus loin, à cet Age, la myéline est déjà très développée dans la substance blanche, et elle paraît opposer une barrière à la pénétration de ce réactif, aussi faut-il alors abandonner le mélange d'alcool et d’acide

osmique pour les sels de chrome et l’acide chromique.

Ces sels, qui ne conservent que d’une manière fort défectueuse les jeunes éléments embryonnaires de la moelle, donnent au contraire d’excellents résultats lorsque ceux-ci ont atteint un certain développement.

De tous les procédés qu’on a recommandés pour l’emploi des sels de chrome, celui qui m’a paru en même temps le [)lus rapide et le meilleur est celui |)réconis(‘ par Deiters ( 1 ). 11 consiste à fixer d’abord les éléments de la moelle dans une solution de bichromate de potasse à 2 pour 100, puis de la porter au bout de quinze jours dans une seconde solution d’acide chromique, contenant 3 parties pour 1000 d’eau de cet agent, oii elle séjourne de quinze jours à un

(U) Deiters, Untcrsuehuiigeii iiher Gehirn und Uuckeiiinark [Ileraus von M. Sc/iutze. Braunsclnveig, 1885, p. 21).

ÉLÉMENTS DE LA MOELLE

mois, enfin d’on achever le durcissement par l’alcool.

J’ai trouvé qu’il y avait grand avantage à infiltrer de la celloïdine, avant de les couper, les fragments de moelle ; la coupe, moins friable, peut être l)eaucoup plus facilement manipulée, ceci est d’un grand avantage; on sait combien la moelle de l’adulte se brise facilement lorsque la coupe est mince, celle des embryons l’est encore beaucoup plus, et sans l’emploi de cette substance, on serait forcé de faire des coupes beaucoup plus épaisses, ou d’en perdre un grand nombre pour en avoir une seule bonne, ce qui revient à une perte de temps considérable. C’est pour m’éviter cette perte de temps, qui doit toujours être prise en considération, que je me suis presque toujours servi du microtome que Thomas lit construire en se basant sur le principe de celui de Rivet.

Les coupes une fois faites ont été colorées soit par le picro-carminate d’ammoniaque, soit par l’iiématoxyline, soit par le carmin aluné acide, etc.

M. Ranvier (1), dans son cours de l’année 1882, a indiqué un procédé excellent pour n’avoir que les noyaux et les cylindres d’axe colorés dans la moelle, après qu’on l’aura fait durcir dans les sels de chrome et colorée par le picro-carminate d’ammoniaque, c’est de mettre les coupes, après les avoir colorées pendant 24 heures dans un mélange, d’une partie d’acide formique et de 2 parties d’alcool. J’ai fait un grand usage de ce procédé pour l’élude de la moelle aux dernières périodes de la vie embryonnaire.

J’ai aussi employé, pour l'étude des premiers stades du développement, un mélange d’acide chromique à 3 pour 1000 et d’acide osmique à 1 pour 100, dans la proportion de 9 parties de la première solution pour une parlie de la seconde; ce réactif m’a donné quelquefois de très bons résultats, ainsi que celui formé par 9 parties de solution saturée d’acide picrique et de 1 de solution à 1 pour 100 d’acide osmique; il est nécessaire de laisser séjourner les fragments de moelle ou les petits embryons pendant plusieurs jours dans ces solutions; on achève toujours le durcissement par l’alcool.

(1) Ranvier, Comptes vendus de i’Acad. des sc., 27 nov. 18S2.

4G SYSTIÎME NERVEUX CÉRÉBRO-SPINAL

Enfin, je dois aussi menlionner que quelquefois, avant de mettre les très jeunes embryons dans le mélange d’acide osmique et d’alcool dont j’ai parlé plus haut, je les laissais macérer pendant 12 ou 24 heures dans de l’alcool au tiers (alcool à 85° centésimaux), afin d’obtenir une légère dissociation des éléments; mais je ne puis recommander ce procédé, quoiqu’il m’ait donné quelquefois de très bons résultats, et que son emploi soit excellent pour d’autres parties du svstème nerveux central, car son action n’est pas toujours certaine, et souvent il ne donne que de très mauvaises préparations.

Lorsque j’avais à rechercher les points où la prolifération des éléments était la plus active, ou à m’assurer que telle ou telle forme du noyau correspondait bien à une forme réelle ou bien n’était que celle d’un noyau en voie de division, je me suis servi d’une méthode qui m’avait été recommandée par mon ami le !)*■ ITenneguy; elle consiste à plonger pendant un temps variant entre 10 et 20 minutes les jeunes embryons dans un mélange formé de 1 centimètre cube d’acide osmique en solution à 1 pour 100, un centimètre cube d’acide acétique et 100 centimètres cubes d'acide picrique en solution à 1 pour 100, puis à les laisser séjourner pendant 24 ou 12 heures dans le liquide de Kleinenberg, enfin d’en achever le durcissement par l’alcool en commençant par de l’alcool à 00° centésimaux, puis en em- [)loyant des alcools à 70", 80° et 90°.

La pièce ou rembryon est ensuite coloré en masse par le carmin aluné acide.

Parallèlement à ce liquide j’en ai employé deux autres recommandés pai’ Flemming dans son traité sur la division cellulaire. Le premier se compose de :

Eau

Acide cliroiiiiqiie Acide acétiffue. .

Acide osmique. .

100 ccntinièlres cul»es.

centigrammes.

1 centimètre cube.

1 décigramme.

Les tissus durcis dans ce liquide et colorés ensuite par riiématoxyline laissent voir admirablement bien les ligures chromatiques.

éléments F3E L\ MOELLE.

Le secoml, bon surtout pour l’étude des figures achromatiques, SC compose de :

100 ceuti mètres ciilies.

Ackie cliromique 25 cenligrummes.

Acide acétique ^ decigi anime.

J’ai du reste employé pour la recherche de ces figures presque tous les procédés recommandés pai’ cet auteur, car j'avais un intérêt spécial à les rechercher dans certains points de la moelle faussi, pour éviter de longues redites,

je renvoie au traité de Flemmiug (1).

J ai employé l’acide osmique eu solution 1 0 0 afin d ohteuir une coloration intense de la myéline, coloration qui est utile pour l’étude de certains détails. A cet effet, je divisais la moelle en très petits segments, que je laissais séjourner pendant vingt-quatre heures dans ce réactif, le durcissement était ensuite complété par 1 alcool. ^lais il ne suffit pas, pour étudier le développement des éléments de la moelle, d’en faire des coupes, on n’aurait par ce procédé que des notions bien incomplètes sur les éléments la formant, il faut aussi les dissocier.

Après avoir tenté les solutions faibles d’acide chromique et de ces sels, etc., je suis arrivé h rejeter tous les procédés employés généralement pour n’en conserver que deux. Le premier est la dissociation ordinaire avec des aiguilles, que j’employais après avoir fixé des fragments de moelle par l’acide osmique en solution à 1 p. 100. Le . second est celui qu’a indiqué M. Ranvier (2) dans la communication qu’il fit à l’Académie des sciences à propos de la névroglie ; il consiste à laisser u un segment de la moelle séjourner vingt- quatre heures dans l’alcool au tiers, on en \ > détache de petites portions et on les agite avec de l’eau distillée dans un tube à expériences, jusqu’à ce qu’elles soient dissociées ; on ajoute du picro-carmin pour colorer les éléments, puis on les laisse se déposer au fond du tube.

Un les recueille au moyen d’une pipette et on les porte dans lin autre tube contenant de l’eau distillée, à laquelle

(1) Fleiimüiig, Zcllsubstanz, Kern und Zelltheilung. Leipzig, 1SS3 {Berner- ^ kungen iiher Reagenlien, p. 3*9).

(2) Ranvier, Comptes rendus de l'Acad. des sciences, 5 juin 1882.

systi'::me nerveux cerebro-spinx\l.

on ajoute de l’acide osmique (quelques gouttes d’une solution au ccniLièiiie). Lorsqu’ils ont gagné le fond du vase, on les prend de nouveau avec la pi(>ette pour les examiner au microscope (1). »

Par l’emploi de ce |)rocédé de dissociation, on obtient surtout avec les moelles embryonnaires une complète dissociation des éléments; mais, ]K)ur la facilité de rélude <|ue j’ai faite, j’ai été conduit à préciser certains détails de la manipulation. En ellèt, les éléments sont ])lus ou moijis colorés en rouge, suivant la quantité de picro-carminate <rammoniaque qu’on ajoute à l’eau qui les tient en suspension ; ils sont également plus ou moins bruns, suivant le nombre de gouttes d’acide osmique qu’on met dans le tube pour les lixer. Si cela n'a pas grande importance pour les éléments adultes, il n’en est pas de même pour les éléments d’une moelle venant d’un embryon d’un certain âge, qu’il faut comparer avec ceux d’une moelle d’un âge plus ou moins avancé de manière à ce que toutes les préparations de la série du développement soient comparables entre elles.

A cet elfet, j’agitais mes fragments de moelle dans uiu' quantité d’eau déterminée, 15 centimètres cubes, à laquelle j’ajoutais 1 centimètre cube d’une solution à 1 p. 100 de picro-carminate d’ammoniaque. Lorsque les éléments étaient colorés et reportés dans un second tube contenant de l’eau distillée, j’ajoutais de l’eau jusqu’à ce qu’elle eiit de nouveau le volume de 15 centimètres cubes, et j'y mettais 1 centimètre cube d’une solution à 1 p. 100 d’acide osmique, je bouchais le tube et je laissais l’acide osmique agir pendant vingt-quatre heures.

Au bout de ce temps, les éléments sont tous précipités au fond du tube. Je décantais alors le j)lus possible l’eau avec une pipette, j’ajoutais de nouveau un peu d’eau distillée, afin d’enlever l’acide osmique <{ui ne s’était pas réduit sur les éléments. Lorscpie cenx-ci s’étaient de nouveau précijdtés au fond du tube, je décantais de nouveau l’eau, je prélevais une petite quantité d’(déments que je mêlais avec quelques gouttes d’uue solution à 1 p. 1000 d’acide plié-

. (I) Ranvier, De la uévroglic {Arch. de physioloffie, 1.^ février 1883, p. 180).

ÉLÉMENTS DE LA MOELLE

nique, et j’ajoiilais au reste une quantité convenable de glycérine gélatinisée qui, après avoir été rondiie à une douce chaleur, était agitée avec les éléments dans le tube à analyse, de maniéré a disperseï' ceux-ci dans toute sa masse.

Il suffit, pour obtenir une pi'éparatioii, de déposer une

goutte de ce liquide sur une lame, et lorsque la goutte est refroiilie, de la recouvrir d’une lamelle. En faisant fondre à la chaleur de la main la glycérine gélatinisée, on obtient ainsi des préparations de toute beauté ; les prolongements cellulaires, entourés de toute part par une masse visqueuse assez épaisse, restent étalés et ne sont pas projetés tous dans un sens, comme il arrive trop souvent avec les autres procédés.

Quant aux éléments que j’avais placés dans une solution h 1 p. 100 d’eau pbéniquée, je les montais en préparations persistantes dans une cellule. La cons.gryation^dans l’o^J-ké niquée a, le grand avantage sur la glycérine ou la glycérine gélatinisée de laisser facilement visibles les moindi'cs détails de réfringence. Beaucoup des figures que je donne, surtout celles relatives à la névroglie, ont été dessinées d’après des préparations conservées par ce

procédé.

Pour l’étude des fibres nerveuses, j’ai employé l’acide osmique en solution à 1 p. 100 ; je faisais macérer de petits fragments de la substance blanche dans ce réactif pendant vingt-quatre heures, et je les dissociais ensuite avec des aiguilles. Souvent il est avantageux de traiter les préparations par une goutte d’ammoniaque, comme Exner (1) l’a fait pour le cerveau, car ce réactif dissout toutes les granulations qui se trouvent autour des fibres nerveuses; mais, après son emploi, on ne peut conserver les préparations, aussi ne faut-il pas s’en servir, si on désire avoir des préparations persistantes, à moins de les exposer après faction de l’ammoniaque aux vapeurs d’acide osmique, comme le recommande M. Ranvier (2).

Si j’ai décrit aussi minutieusement la technique que j’ai employée, c’est qu’elle a une grande importance, au point

(1) Exiler, Zur Kemitniss von feiner Bau der Grosshirnrindc {ComjAes rendus de l'Académie de Vienne, t. XXXIII, 1881).

(■2) Ranvier, Traité technique.

ViGXAL. — Système nerveux. 4

3('f SYSTÈME NERVEUX CÉRÉBRO-SPINAL.

lie vue des résultats. Les éléments de la moelle fœtale et embryonnaire sont en elTet excessivement altérables et s’ils ne sont pas traités par des réactifs convenables, il se produit des altérations si considérables, que l’étude des éléments devient impossible ; pour cette raison je rccomïiiande de n’employer que des embryons encore cbaiids ou sortis de la mère au plus depuis deux ou trois heures.