ARE
Etude comparée des différentes méthodes d’extraction de mise er évidence de caractérisation des dérivés barbaturiques dans l'urine
Essai d’une méthode rapide Etude de sa technique d'exécution de sa sensibilité de sa spécificité
Fi Ne f fe % | N L ‘à NATALE ET DE Mere NTM)
Les premières techniques utilisées pour extraire les dérivés barbituriques de l'urine se sont inspirées de la méthode de Sras.
En 1850, le célèbre chimiste belge Sras, à propos d'un empoisonnement par la nicotine, imagina une méthode qui permit d'extraire systématiquement les alcaloïdes dans les viscères d'individus intoxiqués par les poisons végétaux.
Cette technique extrait, non seulement les poisons végélaux et les alcaloïdes, mais encore de nombreux glucosides, les barbituriques, et d’autres corps tels que les bases puriques (caféine, théobromine), les composés de lacide benzoïque (acide salicylique et ses dérivés: salicylates et aspirine).
Voici en quelques mots la méthode de STAs :
Une première opération permet d'obtenir, à partir des viscères, un résidu aqueux et acide dans lequel on recherche les barbiluriques. Nous ne nous en occuperons pas ici, puisque nous partons de lurine.
Dans une deuxième partie, Sras traite ce résidu aqueux avec + ou 5 fois son volume d’éther. L’éther est décanté et évaporé. Le résidu obtenu est alcalinisé et épuisé à nouveau 3 ou 4 fois par léther.
Cette méthode appliquée à lurine exige emploi de grands volumes d’éther, et aboutit à un résidu très impur, fortement coloré par les pigments uri-
naires.
Cette méthode a été perfectionnée par OTro, puis par OGiER et KonN-ABREST, qui ont introduit un premier passage à l'alcool avec distillation dans le vide, puis une purification par laluminium activé, Cette excellente méthode est très longue, ne peut être faite que dans un laboratoire de toxico-
logie, et ne saurait nous intéresser ICI.
Nous en reliendrons loulefois que l'élher est un solvant capable de s'emparer du barbiurique re-
tenu dans une solulion aqueuse el acide.
Dans la méthode d’'ERDMANN et Usrar, l’extraction est réalisée par Falcoo! amylique. C’est un solvant coûteux, son maniement est désagréable, ses vapeurs sont nuisibles, et il ne présente pas d'avantage particulier.
DRAGENDORFF, dans une méthode toxicologique d'extraction des poisons des viscères, utilise successivement différents solvants judicieusement choisis, et arrive ainsi à établir des groupements, un peu comme en chimie analytique minérale on établit des familles. Cette technique nous a révélé que différents liquides pouvaient jouer, vis-à-vis des barbituriques, le même rôle que léther, et nous à Conduit, ainsi que nous le verrons plus loin, à essaver la benzine et léther de pétrole.
VAN ITALIE en 1919, extrait le barbiturique de l'urine par la méthode de Sras-Orro-OGiEr: il fait agir sur le barbiturique divers sels métalliques,
l’azotate d'argent notamment, qui ont la propriété
de donner avec certains uréides (tous n’ont pas été essayés par cet auteur) des combinaisons cristallisées bien définies. Le diagnostic est fait exclusivement par l’aspect microcristalliné, Cette méthode, assez précise, ne peut convenir qu'à un techni-
cien tres habitué aux recherches microchimiques.
FABrE, en 1922, a utilisé la propriété que possèede l’urée et ses dérivés de former avec le Xanthydrol des composés stables (propriété bien connue utilisée par Fosse pour. le dosage de l’urée sanguine). Il suffit alors de prendre le point de fusion du dérivé xanthylé ainsi formé: il est caractéristique du barbiturique recherché. Mais il faut pour exécuter une semblable méthode extraire une forte quantité de toxique, et la mesure d’un point de fusion est une opération délicate, ainsi que nous le verrons plus loin quand nous décri-
rons les procédés d'identification.
KOHN-ABREST, dans un article intitulé « Les Hypnotiques de la série barbituriques en Toxicologie » décrit ainsi la façon dont il applique à l'urine la méthode de STross - Orro : « L’urine est concentrée par évaporation, puis acidifiée à lPalcool tartrique à 1 %. Elle est ensuite distillée jusqu'à départ complet des dernières traces d'alcool. On cpuise alors le résidu au pétrole léger. On extrait enfin le barbiturique par l’éther, que l’on recueille par décantation.
La caractérisation est faite par la méthode de FABrE en recherchant le point de fusion du dérivé
xanthylé.
En 1921, VAN ITALLIE et STEENHAUER, d’une part, FABRE, d'autre part, modifient le procédé d’extraction de Sras-Orro, en déféquant au préalable
l'urine par l’acétate de plomb.
Parri, en 1924, donne une réaction générale d'identification, positive pour tous les dérivés de la malonvylurée. La voici textuellement :
« On prend un peu de sel de cobalt (chlorure ou nitrate) qu'on traite par quelques gouttes d’ammoniaque en très léger excès; il se forme un précipité bleu-vert gélatineux. On introduit rapidement une parcelle de véronal et lon agite. On obtient 1mmédiatement à froid une coloration rose intense et magnifiique tendant au violet; le liquide est limpide. La coloration tend au violet avec la quantité strictement nécessaire d’ammoniaque et au rose avec une quanilté plus forte de base. Un excès de celle-ci détruit complètement la réaction, le milieu
prenant une teinte jaune-brun ».
Douris, dans son « Traité de Toxicologie Moderne » conseille de faire la réaction de la façon suivante :
« Prélever avec un canif quelques parcelles de résidu ; ajouter 0 ce., 5 d’alcool, une gouttelette d’azotate de cobalt à 10 % et une goutte d’ammioniaque au dixième: coloration mauve. »
Cette réaction très simple et très caractéristique a été modifiée et perfectionnée par de nombreux auteurs ; C’est ainsi que SWIKKER (1931), BODEN- DORFF (1932), KoPpanyr (1933), KosELKA et TATUM
Rte
(1937), ont cherché a remplacer le nitrate ou le chlorure par des molécules organiques combinces au cobalt, et l’ammoniaque par des hydroxydes alcalins ou alcalino-terreux, de l’éthylate de sodium, des amines aliphatiques ou aromatiques. PESEZ (1938) la pratique avec du chlorure de cobalt et de la soude en présence de chlorure de calcium. PAGET et DEsopr (1933) avec du nitrate de
cobalt et du cyanure de potassium.
CHARONNAT et LACHAUX (1936) ont remarqué que la réaction était plus intense en milieu glycériné. Enfin (et Parri en avait déjà fait la remarque en 1929) c’est en milieu alcoolique absolu que la réaction est la plus belle et la plus sensible. Nous avons utilisé pour nos recherches la technique de GRIF- FON ét LE BRETON que nous indiquerons plus loin en détails. Nous montrerons aussi que cette réaction donne une coloration rose avec les dérivés de l'acide benzoïque, et nous verrons comment on
peut éliminer cette cause d'erreur.
En 1933, FagrE, pour éviter l’emploi de grands volumes d’éther nécessaires à lextraction par la méthode d’OGter, pratique l'extraction continue:
KoPppaxyr, MurpPay et Krop, en 1933, défèquent l'urine, avant d’extraire par Péther, en y mêlant une solution de sulfate de cuivre, qu'ils précipitent
par la potasse.
PaGETr et DESODT, la même année, partent du même principe, mais utilisent le ferrocvanure de potassium et l’acétate de zinc.
FLEURY et GRINNEBAULT font remarquer que ces différentes défécations par précipitation peuvent entrainer une diminution du rendement de lextraction, car elles occasionnent une perte par fixation du barbiturique sur le précipité.
LoBo (1934) fait remarquer que cet inconvénient existe surtout si l’on travaille sur des urines alcalines.
GRIFFON et LE BRETON (1938) disent qu'on peut échapper à cet inconvénient en utilisant l’acétate neutre de plomb (réactif de COURTONNE), ou en réalisant la défécation en milieu très faiblement acide.
SWIKKER, en 1934, a décrit un procédé d’identi-
fication à l’aide d’un réactif cupro-pvridique.
FoucET, la même année, reprend cette méthode et met au point une technique, dont l’exécution demande environ une heure :
1°) L’urine est traitée par un dixième de son volume de réactif de Courtonne et filtrée. Le filtrat doit être nettement acide. Il est épuisé deux fois avec la moitié de son volume d’éther ordinaire ou mieux d’éther acétique. I’éther est décanté et lavé deux fois avec la moitié de son volume d’eau distillée. Le barbiturique passe ainsi dans l’éther.
L'auteur reprend cet éther par une solution aqueuse ammoniacale à 4%, et obtient ainsi ure solution alcaline du barbiturique. Il chasse au
ho
bain-marie l’excès d’ammoniaque et concentre un peu le liquide.
2°) Pour caractériser le barbiturique, on prépare une solution de sulfate de cuivre à 3 % additionnée d'un léger excès de pyridine (jusqu’à redissolution de l'hydrate) et on le centrifuge afin d’avoir un réactif clair.
3) On met dans un tube deux ce. du réactif cupro-pyridique et quelques ce. du liquide à étudier et on doit obtenir de suite un précipité violet clair caractéristique.
Or nous avons à plusieurs reprises essayé cette réaction en suivant très exactement le manuel opératoire indiqué par Foucer. Nous n’avons jamais obtenu le précipité violet pour des quantités de barbiturique correspondant à ce qu’on retrouve habituellement dans les urines des intoxiqués. Peut-être faut-il incriminer lPéchantüllon de pyridine qui nous a servi ?
L'auteur propose de poursuivre lidentification exacte du toxique en opérant de la façon suivante:
Centrifuger, recueillir le précipité, le laver, le sécher, le dissocier à la chaleur en barbiturique qui se sublime et qu'on peut « reconnaître par comparaison avec un produit connu. »
Certains barbituriques avant un radical méthyle substitué sur l’un des azotes, tels que le Prominal et l'Evipan, ne donneraient pas, d'apres FOUCHET,
de précipité violet.
SrrAUB et MikaLovits, en 1934 (mais leurs tra-
vaux ne furent publiés dans la littérature française qu’en 1937), traitent également l'urine par défécation préalable au moven d'acide sulfurique et de permanganale en excès. Il se forme un précipité brun dans une liqueur violette, que l’on décolore au perhydrol. On ajoute 0 gr. 1 de charbon officinal, on chauffe à 70°-80", on filtre et on lave à l'eau chaude. L’extraction est faite à l’acétate d’éthyle.
Cette méthode minutieuse donne un résidu assez
pur et n’exige pas un matériel très perfectionneé.
MonrscHULrZ (1934) traite l'urine à chaud par le charbon et prétend que le barbiturique est absorbé. Il en réalise l’élution par lavage des résidus au chloroforme. Nous verrons plus loin que les expériences que nous avons faites au sujet de cette méthode nous ont montré que la quantité de barbiturique absorbé était négligeable, ou en tous cas suffisemment faible pour que le charbon pût être utilisé pour débarrasser l'urine de ses pigments, sans perdre pour cela une trop grande quantité de toxique.
CHARONNAT Gt LACHAUX (1936) réalisent le relargage du barbiturique sous l’action d’un sel neutre (sulfate d’ammoniaque). Cette technique est rapide mais peu sensible, car l’insolubilisation des barbituriques dans ces conditions n’est efficace que pour des concentrations supérieures à 200 mg. par litre durine (GRIFFON et LE BRETON).
GRIFFON et LE BRETON, en 1938, mettent au point un procédé, qui « évitant la défécation, réalise
l'extraction, la purification du solvant et l’évapo- ‘ation de celui-ci en une seule opération et en quelque sorte automatiquement, »
En voici le principe : l'urine acidifiée à l’acide acétique est triturée avec du sulfate de sodium anhydre, ce qui conduit à une masse pulvérulente et sèche. Un traitement de cette masse à l’éther extrait le toxique, des pigments, des acides libérés par lacide acétique, l'excès d’acide acétique et de l'eau.
Cette solution éthérée est alors filtrée sur les trois produits suivants : sulfate de sodium anhydre, magnésie et charbon actif, où elle est neutralisée, déshydratée et débarrassée de ses pigments.
Les auteurs notent que le pouvoir absorbant du charbon pour les barbituriques en solution dans léther est négligeable.
Grâce à un dispositif, dont ils donnent la description, l’éther est évaporé à mesure de son écoulement dans le tube même où se fera la caractérisation. Extraction et évaporation se font ainsi en même temps, en une seule opération. Malheureusement le dispositif en question exige un montage
de verrerie très complexe.
Après avoir fait ainsi l’analvse des différentes méthodes d'extraction, essavons de voir synthétiquement quelles sont les opérations nécessaires pour arriver à un résidu sec et pur du toxique à
partir de lurine.
La défécation
Un point est commun à toutes les techniques : c’est l’application du principe de Sras : lPéther s'empare du barbiturique contenu dans une solution aqueuse acide.
Or si l’on traite directement l'urine acide par l’éther la décantation est toujours très longue et incomplète, souvent impossible, car il se forme des émulsions tenaces. C’est pour éviter cet inconvénient majeur que beaucoup d'auteurs ont cherché à déféquer l'urine avant de la traiter par l’éther.
Nous avons essayé de déféquer :
à l’acétate de plomb (VAN ITTALIE et STEENHAUER),
au sulfate de cuivre et à la potasse (KOPPANYI),
au ferrocyanure de potassium et à l’acétate de zinc (PAGET et DESODT),
au réactif de Courtonne (LOBO, FOUCHET),
à l’acide sulfurique et au permanganate de po-
tassium (STRAUB et MIKALOVITS),
et nous avons toujours obtenu :
1°) des émulsions avec l’éther, souvent moins génantes il est vrai parce que moins tenaces, mais qui retardent pourtant longtemps l'extraction;
2°) une solution éthérée colorée par les pigments de lPurine, qui donnait par évaporation un résidu brunâtre qui rendait très difficile, souvent impossible l'appréciation d’une réaction colorée.
L’extraction
Nous avons vu que si l’éther sulfurique ordinaire était le plus souvent employé, certains auteurs accordaient leurs préférences à d’autres solvants. |
C’est ainsi qu'ont été utilisés :
l’alcool amylique par ErDMaANx et UsrAR, l’acétate d’éthyle, le chloroforme par MOHRSCHULTZ, l’éther acétique par FoUcHET, par STRAUB et MIKALOVITS.
Recherchant une méthode simple, nous n’avons voulu essayer que des solvants d'usage courant, que tout médecin a sous la main. (I est bien évident qu’il ne peut être question que de liquide in-
solubles dans l’eau).
Konx-ABrEsr nous dit que le pétrole léger n’entraîne pas le barbiturique. Nous avons expérimenté l'essence minérale, la benzine, l’éther de pétrole.
L’essence minérale ni la benzine n’entrainent des quantités de barbituriques suffisantes nour être identifiées. Par contre léther de pétrole donne d'excellents résultats. Toutefois, il semble awil donnerait plus facilement des émulsions que l’éther sulfurique. T1 est aussi plus long à évanorer. Et surtout les utilisations multiples de l’éther sulfurique en font un produit beaucoup plus répandu,
toujours à la portée du praticien. Nous nous en tiendrons donc à léther sulfurique par lextrac-
tion.
La purification
Cet éther s’est chargé de pigments et d’autres substances de « lPextractif >» urinaire. GRIFFON et LE BRETON ont indiqué qu’en le filtrant sur char-
sénants, sans
bon, on le débarassait de ces corps gê
absorber le barbiturique.
Mais ne pourrait-on pas faire cette purification en même temps que la défécation ? Quelle serait
la proportion du toxique absorbé ?
MoHrSCHULTZ traite l’urine par le charbon, filtre, et reprend le résidu par le chloroforme. Cette absorption du barbiturique par le charbon est réalisée à chaud par MonrscuLrTrz. Et à froid que se passe-t-il ? L'expérience suivante va nous le mon- Iren
Cinquante ce. d'urine provenant d’une femme intoxiquée par une très forte dose de véronal (elle devait mourir au troisième jour) sont traités par l’acide acétique jusqu’à réaction franchement acide au tournesol. On ajoute une cuiller à café de charbon animal. On agite le mélange dans un verre à l’aide d’une baguette. On filtre, on ne lave pas le résidu.
SEE nan
On recueille ainsi :
1°) 42 ce. de filtrat, incolore et limpide, que nous appelons «EF » ;
2°) Un résidu composé du filtre, du charbon et d'un peu d'urine qui les imbibe. Nous séchons à l'étuve cet ensemble résiduel et nous lappelons «R ».
Nous nous proposons d'extraire le véronal de F et de R par l'éther et de comparer, à l’aide d’une réaction colorée, la proportion du toxique qui est
passée dans F et ce qui est resté dans R.
1°) F est agité avec 25 cc. d’éther et décanté. La solution éthérée obtenue est évaporée à l’étuve, et l'extrait sec est mis en solution dans 10 ce. d’alcool
méthylique absolu. Nous lappelons solution «F » ;
2°) R est repris deux fois par 10 cc. d’éther. La solution éthérée obtenue est évaporée à l’étuve et l'extrait sec est mis en solution dans 10 ec. d'alcool
méthylique absolu. Nous lappelons solution «R ».
On introduit dans une batterie de tubes à hémolyse des quantités décroissantes des solutions R et F, que l’on complète par de Palcoo! méthylique absolu, de facon que le volume réactionnel soit dans chaque tube égal à 2 cc. afin que les colorations obtenues puissent être comparées.
C’est ainsi qu'on introduit dans le tube :
Poet2 cc de F La tce. de F + 1 cc. d'alcool méthylique F3 —0 cc. 5 de F + 1 cc, 5 d’alcool méthylique
F# — 0 cc., 25 de F + 1 cc., 75 d’alcool méthylique
F5—0cc., 1 de F + 1 ce., 90 d’alcool méthylique Mr CC. de R
UC C de R + 1 ce. d'alcool méthylique R5 — 0 cc, 5 de R + 1 cc, 5 d’alcool méthylique Ri = 0 cc, 25 de R + 1 cc; 75, d'alcoolméthylique R5= 0 ec; 11 dé R ET .ce: 90 d’'alcoomethylique
On ajoute à chacun de ces tubes: 0 cc., 5 d’une solution de Nitrate de Cobalt à 3 p. 1.000 et O0 ce., 1 de Diéthylamine à 1 p. 100, suivant la technique de GRIFFON et LE BRETON. On obtient de la sorte une coloration mauve de plus en plus pâle à mesure que diminue la concentration en Véronal, et lon peut à peu près comparer les tubes F? et Rt, F* et R°, ce qui indique qu'il v aurait deux fois plus de barbiturique en F qu’en R, c’est-à-dire que les deux tiers du toxique passent dans le filtrat,
un tiers reste sur le résidu (dont — de F pour le
liquide absorbé).
Nous nous sommes aperçus ultérieurement que la réaction colorée au cobalt était beaucoup plus belle et plus lisible lorsqu'on la pratiquait dans une capsule de porcelaine. Nous avons donc repris expérience précédente, en la modifiant à la lumière des enseignements que nous en avons tirés, et en exécutant la réaction en capsule.
Dans une série d'essais préliminaires, nous avons recherché quelle était la plus petite quantité de
charbon nécessaire pour obtenir un filtrat clair et
[En
un extrail incolore, Nous avons trouvé que 2 cc, de charbon végétal activé ordinaire (celui dont on se sert en thérapeutique gastro-intestinale) suffisait pour 90 ce, d'urine moyennement colorée, el
{ ce, pour une urine fortement colorée,
Nous avons recherché alors :
1") Quelle quantité de barbiturique restait sur le résidu:
2°) Quelle quantité de barbilurique était extraite par un premier {traitement à Péther;
3) Quelle quantité de barbilurique était extraite par un deuxieme traitement à Péther,
A Paide de lFexpérience suivante :
0 ce, d'urine provenant d'une femme intoxiquée par le dial sont {raités par Facide acétique jusqu’à réaction franchement acide au tournesol, On ajoute alors 2 ce, de charbon végétal active (hérapeutique, On agite le mélange dans un verre avec une
baguette, On filtre et on ne fave pas le résidu.
On recueille ainsi
1°) 44 ce. de filtral incolore el Jimpide;
2°) Un résidu composé du filtre, du charbon et d'un peu d'urine qui les imbibe, Cet ensemble résiduel est séché à létuve,
Le filtral est traité par 25 ce, d’éther, On décante el on obtient à peu pres 20 cc, de solution éthérée que nous appelons «EF %,
Le liquide aqueux restant apres décantation est traité à nouveau par 25 cc, d’éther, qui sont éva-
porés dans une capsule «F° >,
MUEUNE
Le résidu de la filtration est repris deux fois à l’éther et cet éther évaporé dans une capsule «R ».
On évapore dans une série de capsules F1, F°, etc, des quantités d’éther de première extraction (F) correspondant à la moitié, au quart, etc., de la quantité totale de F.
On effectue la réaction colorée de GRIFFON et LE BRETON dans les différentes capsules R, F’, F1, F°, etc., et on remarque que R et F° ont une coloration à peu près semblable. L’intensité de la coloration de R et de F° est intermédiaire entre F1 et F°, qui contenatïent:. F1, la moitié de K, et F2, le quart de F.
On peut en déduire, en admettant que l'intensité de la coloration est sensiblement proportionnelle à la quantité de barbiturique contenue dans la capsule, que R et F” contiennent chacun à peu près trois fois moins de barbiturique que F', ou encore :
il reste sur le charbon 2/10 du barbiturique,
une première extraction à léther retire 6/10 du barbiturique,
une deuxième extraction à léther retire 2/10 du barbiturique.
Le charbon, à froid ne retient donc que de 1/5 du poison contenu dans l’urine.
Essai d’une méthode plus rapide
Cette extraction demande parfois plus d'un quart d'heure, et nous avons cherché à simplifier
encore, en supprimant la filtration, qui demande à peu près 10 minutes.
Nous faisons agir directement le solvant sur le mélange urine-charbon. Mais cette opération ne doit pas être faite dans une ampoule à décanta- Uon, où lagitation serait trop énergique. Il s’en suivrait des émulsions irréductibles. Il faut opérer dans un verre, et on agite avec une baguette. L’expérience suivante va nous montrer que le rendement est encore meilleur que lorsqu'on filtre, sans doute parce que lurine est moins longtemps en contact avec le charbon.
50 cc. d'urine provenant d’un coma par lPallonal sont agités dans un verre pendant une minute avec une pincée de charbon. Puis on ajoute 20 cc.
d'éther, On agite une minute avec une baguette de verre. On décante directement léther qui surnage. On en recueille 15 ce. On ajoute 5 ce. d’éther pur pour ramener le volume à 20 ce. Nous appelerons cette solution éthérée «ET».
On pratique une deuxième extraction de la méme facon, et on recueille 20 ce. de solution, qu’on appelle «EF? ».
On filtre, et on épuise le filtrat par 20 ce. d’éther, qu’on appelle <F ».
On sèche le résidu à létuve et on le reprend par 20 cc. d’éther, qu'on appelle «<R ».
On pratique la réaction de GRIFFON et LE BRETON sur l'extrait sec de quantités décroissantes de ces différentes solutions cthérées, jusqu'à ce que la
réaction soit négative.
Pour E!, la réaction encore positive pour lex- 9% )
ts
trait de 1 cc., 5 ; devient négative pour À ce, soit pour 1/16 de l’extrait total Et.
Pour E?, encore positive à 5 cc. devient négative nouritocc, soit. 1/5 -dedl'exfratMotalte"
Pour F et pour R, elle est négative à 10 ce. soit au moins pour la moitié de l'extrait total de F et de R.
C'est-à-dire que :
Une première extraction retire 64% du toxique,
Une deuxième extraction retire 20 ‘ du toxique.
Il reste dans le verre après ces deux épuisenients 16% du toxique.
Cette méthode d'extraction demande quelques minutes.
