INOCULATION
On voit que nous possédons maints procédés dérivés de la bactériologie, directs ou indirects, susceptibles de nous permettre d'établir le diagnostic de la tuberculose sur une base concrète.
Il en est d'autres encore, telles celles basées sur la réaction de Bordet- Gengou, sur la culture, mais qui ne sont pas encore mûres pour la pratique courante.
Il en est probablement de même de Vinoculalion du cobaye. Toutefois, à la campagne, cette méthode n'est certainement pas impraticable. Aussi, pour terminer, nous donnons ci-après, d'après Gastaigne, un exemple concret de mise en œuvre de ces méthodes bactériologiques appliquées eu diagnostic de la tuberculose rénale, souvent si épineux.
Diagnostic de la tuberculose rénale par des méthodes de laboratoire â la portée du praticiea (1). — Deux procédés de laboratoire sont utilisalles par îe praticien pour le diagnostic de la tuberculose rénale :
l^ La recherche des bacilles dans le sédimnt urinaire ;
2° L'inoculation de Turine suspecte au cobaye.
L Recherche des bacilles dans le sédiment uiinaire. — Matériel nécessaire. — 1° Urine prélevée aseptiquement par sondage après toilette et désinfection soigneuse du gland ou de la vulve, et recueillie dans un récipient préalablement bien flambé, puis bouché avec soin une fois rempli ;
2° Une petite centrifugeuse k main avec ses tubes spéciaux que Ton rincera plusieurs fois à l'alcool si on ne peut pas les stériliser;
3° Une tige de platine, ou mieux une pipette ; h défaut, un simple fil de fer flambé ;
40 Des lames de verre porte-objet neuves ;
50 Les solutions colorantes nécessaires pour faire un Ziehl ;
60 De l'alcool absolu ;
70 Un bec Bunsen ou une lampe à alcool ;
8^ Un microscope muni d'un objectif à immersion.
Technique de la recherche. — 1° Remplir d'urine les tubes de la centrifugeuse et centrifuger jusqu'à ce que le liquide soit clarifié ; le culot s'est alors déposé au fond du tube.
On place les tubes dans la centrifugeuse, en ayant soin de bien les équilibrer, c-'est-à-dire de toujours mettre Tun en face de l'autre deux tubes également pleins, pour éviter de fatiguer Tappareil. On met Tinstrument en marche doucement en évitant les à-coups et en augmentant progressivement la vitesse. On centrifuge jusqu'à ce que la limite, soit de la partie supérieure, soit de la partie inférieure, ne change plus, et que le liquide soit tout à fait clair et transparent. Le temps nécessaire pour une centrifugation ordinaire, avec une vitesse moyenne, est d'environ cinq minutes. L'arrêt doit se faire graduellement, sans à-coups brusques, fâcheux pour l'instrument,
(1) Elles ont été décrites dans le Carnet du mois de décembre 1913, auquel il convient de se reporter.
TECHNIQUE BACTÉRIOLOGIQUE 399
et détruisant par contre-coup reffet de la centrifugation (Bard, Précis des examens de laboraloire),
2^ Décanter le contenu des tubes en le versant doucement ; le culot reste au fond ;
3° Avec la pipette ou la tige de platine, déposer une goutte de ce culot sur des lames ; étaler ;
4° Laisser sécher ;
5° fixage de la préparation, soit en passant lentement trois fois la lame dans la flamme bleue du Bunsen, ou dans la flamme de la lampe à alcool, — soit à l'alcool-éther ;
50 Verser sur la préparation une dizaine de gouttes de la solution de Ziehl. Mettre la lame sur la platine chauffante et chauffer doucement jusqu'à apparition des premières vapeurs (60-70°) ; puis laisser la coloration se faire pendant cinq à six minutes environ ; après quoi on égoutte l'excès de liquide colorant ;
7° Sans laver à l'eau, décolorer par l'acide azotique, en versant sur la lame quelques gouttes de la dilution d'acide azotique au quart, qu'on jette au bout d'une minute de contact ;
S^ Décolorer par l'alcool : une dizaine de gouttes d'alcool absolu qu'on laisse agir pendant deux minutes environ ;
90 Laver à l'eau ;
IQo Recolorer le fond de la préparation au bleu de méthylène qu'on laisse agir deux minutes environ ;
11° Laver à l'eau. Laisser sécher à l'abri de la poussière ;
12° Déposer une goutte d'huile de cèdre directement sur la surface de la préparation et regarder au microscope avec l'objectif à immersion et l'oculaire n^ 1 .
Ce que montre la préparation. — Les l^acilles de Koch seul& sont colorés en rouge. Il y a bien dans l'urine des bacilles acido-résiatants autres que le bacille de Koch, mais ils ne sont pas alcoolo-résistants : la décoloration à l'alcool est donc un point très important.
Valeur de cette recherche. — Pour que la recherche des bacilles de Koch dans les urines soit positive, il faut que le malade en élimine beaucoup, ce qui n'arrive qu'assez tard dans l'évolution de la tuberculose rénale.
Aussi est'il souvent besoin, poor dépister cette affection au début, de ne pas s'en tenir à cette seule méthode, mais de pratiquer l'inoculation au cobaye.
Contrôle de la recherchei — A. Emploi d'un sérum agglulinant — sérum de Martnorek par exemple — pour enrichir en bacilles le dépôl de renlrifufjalion.
10 Ajouter à une quantité donnée d'urine (100 centimètres cubes, par exemple), 2 gouttes de sérum par 10 centimètres cubes ; puis abaisser la densité du liquide au-dessous de la densité minima du bacille tuberculeux (1,010) par addition d'alcool à 60^ jusqu'à obtenir une densité do 0,999 ; agiter vivement ;
2® Après sédimentation de vingt-quatre heures, recueillir !a portion inférieure de Turine (30 centimètres cubes) sur laquelle portera Texamen ;
3° Agir différemment selon les cas et suivant la nature du dépôt constitué par : a) des phosphates, alors clarifier par Tacide acétique ; b) des urates, alors chauffer légèrement ; c) du pus, alors traiter par la lessive de soude (une goutte par centimètre cube) ;
40 Centrifugation ;
5° Coloration au Ziehl-Nielsen rigoureuse, c'est-à-dire dix minutes de coloration à chaud ; deux minutes de coloration à Tacide azotique au tiers ; dix minutes de coloration à Talcool absolu (1).
B. Modification de la technique de coloration (procédé de C. Biot, de Lyon).
Une fois la décoloration faite à Tacide (7°) et à Talcool (8°), verser sur le frottis quelques gouttes de formol du commerce à 40 p. 100 ; on le laisse agir pendant deux minutes environ. On ne recolore pas le fond de la préparation.
De la sorte les bacilles apparaissent en violet-noir sur le champ clair du microscope ; le formol a fait virer leur teinte rouge au noir et ils se détachent avec une extrême netteté sur le champ lumineux blanc.
Utilité de la précédente méthode de lal>oratoire appliquée au dia- S^nostic de la tuberculose rénale. — Possibilité de faire un diagnostic précoce dans un cas simplement suspect.
Or un malade atteint de tuberculose rénale et opéré suffisamment tôt peut être sauvé ; un malade chez qui la tuberculose rénale est diagnostiquée de façon trop tardive n*est plus justiciable de la néphrectomie et se Irouve condamné à mort — une mort particulièrement atroce.
La vie du patient est entre les mains du médecin auquel il vient se confier lors de ses premiers malaises.
Mais, négative, ou même positive, cette recherche des bacilles de Koch doit être complétée par Tinoculation de Turine suspecte au cobaye (Cf. Carnet du mois, mars 1914).
II. Inoculation au cobaye. — I. Préparer : l^ urine, pipettes, tubes à centrifuger, etc., comme pour la recherche des bacilles dans Turine ; 2° un verre de montre flambé ; 3° une seringue à injections hypodermiques en verre de 1 centimètre cube préalablement bouillie durant cinq minutes avec son aiguille bouillie et flambée ; 4° un cobaye de 300 à 400 grammes (il est facile de s'en procurer à la campagne).
Technique de l'inoculation. — L'urine une fois centrifugée, on décante le liquide clair surnageant et on prélève avec une pipette le culot que l'on dépose dans un verre de montre bien flambé.
Quand les urines sont très faiblement purulentes, le culot obtenu dans
(1) Lucas, Journal des sciences médicales de Lille, 22 novembre 1913. — Mercier, Thèse de LUle, 1913-1914.
TECHNIQUE BACTÉRIOLOGIQUE
un seul tube serait insuffisant ; on mélange donc le culot recueilli dans 2, 3, 4 tubes de centrifugation, de façon à avoir environ 4 ou 5 gouttes de culot. On les dilue dans 8 ou 10 gouttes d'urine et on aspire ce mélange dans la seringue.
L'inoculation au cobaye se fait en général sous la peau de la cuisse, préalablement épilée, lavée à l'alcool et à i'éther. Si l'on a près de soi un aide, il maintient d'une main la lête et les paltcs de devant du cobay, de l'autre une patte di; derrière, si bien que seule reste libre la patte dans laquelle on fera l'inoci;lution. L'opérateur prend cette patte de la main gauche et fait entre le pouce et l'index un pli h la peau. Tenant la seringue de la main droite, il enfonce l'aiguille suivant l'axe de ce pli et pousse. l'injection hypodermique.
Si l'on est seul, on maintient entre ses jambes le corps du cobaye, lêle en bas, et on laisse dépasser en haut les pattes de derrière.
Lorsque le liquide est ainsi inoculé, il faut retirer l'aiguille en prenant fjg 444..
soin que le liquide ne reflue pas au dehors. On évite cet inconvénient en appuyant un doigt sur l'orifice du trajet de l'aiguille, tandis qu'on la retire.
L'animal inoculé est placé à part dans une cage suffisamment vaste, et isolé des Jiutres cobayes.
Dès qu'il meurt, on l'autopsie pour chercher les signes de tuberculose. S'il vit encore après trois semaines, on le sacrifie pour faire cette vérification. Si deux cobayes ont été inoculés, sacrifier le second six ou sept jours après le premier.
Signes de la tuberculose chez le cobaye. — Hypertrophie du ganglion inguinal du côté inoculé (a). Hypertrophie des ganglions lombaires et
- Tuberculose expérimentale du cobaye (1).
(I) D'après Bahd, Précii ûa DiagnctUe-
dt laboratoirt.
mésentériques. Masse caséeuse dans les ganglions. Granulations blanches sur la rate (b), très augmentée de volume, et sur le foie (c). Parfois granulations sur les poumons. On peut retrouver le bacille de Koch sur des frottis obtenus avec ces lésions (Cf. Carnet du mois, décembre 1913).
9. SYPHILIS. — PROCÉDÉS DIAGNOSTIQUES BACTÉRIOLOGIQUES ET SÉROLOGIQUES DIVERS. '•
10 RECHERCHE DU SPIROCHËTE PALUDUM (surtout valable peur les produits de raclage du chancre).
a) Par coloration des frottis au Giemsa (voir plus haut).
(Il existe d'autres procédés qu'on trouvera dans les traités' spéciaux. Voir Gaston : Laboratoire du Praticien,
b) Par examen â r ultra-microscope (Voir Ibid.).
Ce procédé est relativement simple, facile et rapide. Il est relativement sûr, la distinctiQn;<du spirochète spécifique et des autres variétés de spirilles et de spiroenètes étant, en général, assez aisée. Toutefois, quand le liquide à examiner provient de lésions des muqueuses génitales ou bue- Cîilçs, le diagnostic précis du tréponème reste souvent impossible.
^o SËRO-DIAGNOSTid.' MÉTHODE DITE DE DÉVIATION DU COMPLÉMENT. RÉACTION DE WASSERMANN.
Elle demeure encore jusqu'ici, en dépit des critiques qui lui sont faites, incomparablement plus importante que toutes les autres méthodes de diagnostic de la syphilis par des procédés de laboratoire.
11 n'appartient guère au praticien de pratiquer lui-même ladite réaction, non qu'elle soit particulièrement difficile, mais parce qu'elle nécessite, au moins jusqu'à présent, des réactifs biologiques et une instrumentation (étuves, centrifugeurs, etc.) qui ne peuvent être réunis et conservés que dans des laboratoires spécialisés.
Toulefois son importance est telle que nous rappellerons brièvement :
a) Le principe ;
b) La technique dans ses éléments essentiels ;
c) L'interprétation des résultats obtenus ;
d) Les indications pratiques relatives au mode de prélèvement du sang en vue de ladite réaction.
a) Principe et définition de la réaction de Wassermann. — La
réaction de Wasscrmann, d'un usage actuellement courant dans le diagnostic de la syphilis, est basée, comme on sait, sur la réaction de Bordct- Gengou, désignée souvent sous le nom de déviation du complément. Un bref exposé de cette réaction est nécessaire.
On appelle antigène toute substance (microbes, éléments cellulaireç^, toxines) qui, injectée dans un organisme, provoque une séro-réaction humorale de défense.
TECHNIQUE BACTÉRIOLOGiQVE
On appelle anlicorps la substance développée dans un organisme an cours de la séro-^éaction de défense provoquée par Tioatroduction d*un antigène.
Un sérum complet renfermant un anticorps est bactériolytique, cytolytique, antitoxique par rapport à l'antigène, microbe, cc^Hule, toxine qui a provoqué sa formation.
Par exemple le sérum d'un sujet vacciné au moyen d'»%ïiulsions Ae bacilles d'Eberth est bactériolytique pour ledit ibaeilJe ; le sérum antidiphtérique est antitoxique par rapport h la toxine diphtérique ; le sérum d'un animal auquel on a injecté préalablement des hématies d'une autre espèce est hémolylique par rapport auxdites hématies.
Le sérum d'un sujet normal peut présenter d'ailleurs spontanément ^^ertaines ipropriétés d'anticorps. €'cst ainsi que sans aticttnc pr^^paration le sérum humain hémolyse les hématies du mouton, du lapin, du cochon d'Inde.
L'expérience indique qu'un sérum renfermant un anticorps perd irré-
Réaction hémolytique.
Pas de réaction.
Réaction hémolytique.
Sérum de
cobaye préparé
antimouton)
