C. - EXAMEN CYTOLOGIQUE ET BACTÉRIOLOGIQUE

MODES DE PRÉLÈVEMENT DU SANG. — I. Piqûre du doigt. — C'est la technique la plus simple, employée d'une façon courante pour la numération des éléments du sang, pour la préparation des lames de sang desséché, destinées à établir la formule leucocytaire, ou encore pour rechercher le séro-diagnostic.

On procède au nettoyage sérieux de la pulpe d'un doigt, avec de l'éther, puis on sèche soigneusement. On pique avec un vaccinostyle ou avec une lancette spéciale à déclic, préalablement stérilisés.

La première goutte de sang essuyée avec un linge ne sera pas utilisée.

2. Ventouse scarifiée. — Ce procédé est à la portée de tout praticien qui désire faire effectuer dans un laboratoire la séro-agglutination, l'épreuve de Wassermann, la recherche des pigments biliaires dans le sérum, le dosage de l'urée ou de la glycémie.

Les ventouses auront été stérilisées au préalable, la peau soigneusement nettovée et séchée.

On laisse coaguler le sang dans la ventouse en ayant bien soin de ne pas l'agiter, puis, après coagulation complète, on recueille le sérum par décantation, au moyen d'une pipette à boule.

3. Ponction veineuse. — C'est le procédé de choix. C'est le seul qui permette de recueillir le sang d'une façon absolument aseptique et de l'ensemencer sur les milieux usuels de culture. C'est le seul aussi qui permette de recueillir un sang non modifié par la coagulation ; il permet, en effet, l'adjonction de substances anticoagulantes ; dès lors, par centrifugation, on aura d'une part les hématies, d'autre part le plasma, dans lequel on pourra vérifier l'existence d'une hémoglobinémie, ou bien pratiquer certains dosages, en particulier le dosage de l'urée.

(1) En collaboration avecle D' Lutier.

On choisit une veine apparente quelconque, en général la médiane céphalique. On fait gonfler la veine, en ligaturant le bras avec un tube de caoutchouc maintenu avec une pince à forcipressure. On badigeonne le champ opératoire à la teinture d'iode. On se sert d'une aiguille courte, d'assez fort calibre, stérilisée. On pique d'abord la peau, latéralement à la veine ; puis on enfonce l'aiguille longitudinalement dans la veine jusqu'à ce qu'on voie le sang s'écouler goutte à goutte rapidement. On laisse s'écouler, sans les utiliser, les premières 'gouttes de sang qui peuvent être altérées. On adaptera une seringue à l'aiguille, ou bien on recueillera le sang directement dans des tubes ou des ballons stérilisés.

Techniques générales relatives à l'étude du sang total. — On a comparé le sang circulant à un véritable tissu, dans lequel la substance interstitielle, le plasma^ est liquide et dont les éléments cellulaires sont représentés par les globules rouges et par les leucocytes.

En faisant varier les conditions expérimentales, il est possible d'étudier ces dilTérentes portions constitutives du sang, soit dans leur ensemble, soit au contraire isolément.

Par un examen extemporané, au moyen de la cellule à rigole^ on étudiera le sang frais total. Mais cet examen ne saurait être prolongé, car bientôt le plasma abandonne sa substance fîbrinogène, qui, transformée en fibrine, emprisonne les éléments figurés dans les mailles de son réticulum pour constituer le caillot.

Le plasma transsudé, dépourvu de fibrinogène, est devenu le sérum.

Toutefois, le sérum et le plasma sont loin de posséder des propriét<^s identiques ; aussi est-il souvent nécessaire d'entraver la coagulation du sang au moyen d'artifices de technique, pour dissocier rigoureusement la substance interstitielle et les éléments figurés du sang.

Récolle du sérum et déplasmatisation des hématies figurent parmi les méthodes courantes en hématologie.

Enfin, pour apprécier le nombre, la forme, les dimensions, les affinités tinctoriales des éléments cellulaires, on peut avoir recours aux méthodes hémalimétriques et à la préparation du sang sec étalé sur lame, fixé et coloré.

Telles sont les méthodes élémentaires qui se trouvent à la base de l'étude du sang.

Récolte du sérum. — On recueille du sang par ventouse scarifiée ou ponction veineuse.

La coagulation doit s'opérer lentement sans aucune agitation du vase qui contient le sang. Lorsque le sérum a transsudé, on le recueille par décantation, au moyen d'une pipette à boule. On peut le centrifuger, s'il contient encore des globules rouges.

Récolte du plasma. — 11 suffît de recueillir le sang dans un tube à centrifuger renfermant une solution anticoagulante (voir plus haut : Résistance globulaire)^ dans la proportion de trois quarts de liquide pour un quart de sang. On effectue le mélange, puis on centrifuge.

Le culot de centrifugation est constitué par des hématies déplctsmaliséts^

Fig. 283.

-ià^

des globules blancs, et Ton peut recueillir par décantation le plasma qui surnage, mélangé au liquide anticoagulant.

Préparation de sang frais. — On se sert de la cellule à rigole, qui se compose d'un petit disque plan, de 3 à 4 millimètres, séparé du reste de la lame par une rigole circulaire. Son niveau est un peu inférieur à celui de la lame, si bien que la lamelle, une fois placée, repose uniquement sur la lame. I/espace libre entre la face inférieure de la lamelle et la surface du disque permet à la goutte de sang de

s'étaler en couche mince et d'être à l'abri de l'air. Avant de faire la préparation, on enduit le pourtour de la rigole d'un peu de vaseline, de manière à obtenir l'adhérence de la

lamelle; on devra se servir d'une - - -^^.

lamelle rodée (voir fig. 283).

Après avoir nettoyé le doigt à l'éther et séché soigneusement pour éviter l'altération des éléments du *ang, on fait une piqûre et on recueille une goutte de sang sur le petit disque de la lame, en évitant que la lame touche la peau. Plus commodément, on recueillera la goutte de sang au bout d'une petite baguette de verre pour la déposer sur la lame. ^ ^.^

La lame, la lamelle et la baguette ^ '

de verre doivent être d'une propreté pj^. 284. — Réticulum fîbrineux nornia absolue, dégraissées à l'alcool ou à l'éther, et essuyées encore humides avec un linge fin non filamenteux.

Cette préparation, facile et rapide, donne des renseignements d'une

(Grossissement : 500). Les globules rouges disposés en piles de monnaie n'existent que par îlots. Dans l'interstice appelé néoplasmatique on voit un globule blanc et des hématoblastes d'où partent des aiguilles fibrineuses.

grande valeur diagnostique. Elle

permet d'évaluer le nombre respectif des éléments figurés, de constater leurs altérations morphologiques (forme, volume, pigmentation), d'apprécier la viscosité des hématies et l'importance du réticulum fîbrineux, et de dire, dans certains cas, si Ton a affaire à une maladie phlegmasique ou pyrétique, à une leucocytose ou à la leucémie, etc., de déceler une inflammation méconnue, une suppuration cachée, de découvrir les pseudo-parasites et les

vrais parasites d'un certain volume (filaire, hématozoaire, spirille), et le& eellules étrangères au sang.

L'examen à la platine chauffante facilitera l'observation des parasites^ des mouvemei^ts amiboldes (fig. 285).

Fig. 285.

218 EXAMEN DE VAPPAR^IL CIRCULATOIRE

NUMÉRATIONS GLOBULAIRES. — Pour la numération des globules jouges, des globules blancs et des hématoblastes, on se sert d'hématimètres dont il existe plusieurs types. Nous décrirons Thématimètre de Hayem.

Quel que soit rhématimètre employé, il faut recueillir le sang dans un liquide qui conserve intacts les éléments du sang (c'est-à-dire un sérum isotonique) et qui les disperse d'une façon uniforme.

La plus grande propreté est indispensable pour les pipettes, les lames porte-objet et les lamelles, qui doivent être lavées à Teau distillée et ■essuyées avec soin.

Liquides de numération. — Liquide A de Hayem, le plus employé, avec lequel on peut numérer tous les éléments, globules rouges et blanc?, «t, dans certains cas pathologiques, les plaques phlegmasiques ou cachectiques.

Eau distillée 200 centimètres cubes.

Chlorure de sodium 1 gramme.

Sulfate de soude 5 grammes.

Bichlorure de mercure 0«',50

(Filtrer de temps à autre.)

On a imaginé des liquides colorés pour faciliter la numération des globules blancs. Voici une formule de M. Toison :

Violet de méthyle 5 B 0«%25

Chlorure de sodium 1 gramme.

Sulfate de soude pur 8 grammes.

Glycérine neutre 30 centimètres cubes.

Eau distillée 160 —

(Filtrer.)

Pour faciliter la numération des leucocytes, on peut employer des licpiirles qui dissolvent les hématies. Par exemple :

Aride acétique cristallisablo 1 gramme.

Eau dislillée 100 à 300 centimètres cubes.

(Filtrer.)

Objicctiis a employer. — On emploie un objectif 5 ou 6 (Stiassnie) avec un oculaire 1 ou 2, ou un objectif 6 ou 7 (Leitz) avec un oculaire 1 ou 2. On obtient ainsi un grossissement de 200 à 300 diamètres.

Hkmvtimètre de Hayem (Nachet). — Le mélange du sang et du sérum se l'ait dans une petite éprouvette à l'aide de deux pipettes (fig. 287). On emploie la première pipette pour recueillir un de mi -centimètre cube de sérum, qu'on laisse tomber dans l'éprouvette. Puis, avec la seconde pipette, on recueille2 millimètres cubes de sang ; on essuie bien la pointe de la pipette ; puis on mélange le sang avec le sérum dans l'éprouvette. Pour bien assurer le mélange, après avoir chassé tout le sang contenu dans la pipette, on lave celle-ci avec le sérum de l'éprouvette, en aspirant, puis en soufflant plusieurs fois de suite. Enfin, on assure l'homogénéité du mélange en agitant le contenu de l'éprouvette avec un petit agitateur en verre à palette, djnt on fait rouler vivement le manche entre les doigts. La numération

se fait à l'aide d'une lame à cellule. C'est une lame de veri-e à faces bien planes, sur laquelle est collée une lamelle rigoureusement plane, perforée à son centrp d'un trou de 1 centimètre de diamètre, la lamelle mesurant un cinquième de millimètre d'épaisseur exactement. Cette lame-cellule repose sur un porte-objet métallique muni d'un système de lentilles disposé de manière à projeter sur le fond de la cellule l'image d'un réseau qua-

Fig. 26Q. — riËmal'mèlr? de llayem sous le nticroscope.

drille mesurant en tout un cinquième de millimètre de large et divisé en seize petits carrés. On dépose dans la cellule une goutte du mélange de sang et de sérum, et l'on recouvre d'une lamelle à faces rigoureusement planes. Il faut bien faire attention de ne pas mettre un excès de liquide dans la cellule ; autrement, il s'insinuerait entre la lame et la lamelle, et les résultats seraient faussés. 11 faut mettre une goutte assez petite pour que, la lamelle étant mise en place, le liquide soit entouré d'un anneau d'air complet. On assure l'adhérence parfaite de la lame et de la lamelle en humectant légèrement le pourtour de celle-ci de salive ou d'eau ;

une quanlité infime de liquide pénètre sous elle par capillarité et empêche ■tous les glissements.

Pour (aire U numération, on attend quelques minutes, afin que le?

fit;. îfilt.

slol.nlos aiont le temps di> i^<: déposer au fond de la cellule (fig. 290 . Numération des globules rouges. — Puis on compte les globules rouges contenus dans ii' r'''sn;iii iiuadrillé, en suivant un ordre fixe, pour ne pa; rompter deux fois les mÉmep globules, et l'on ne compte, parmi ceux qui sont à cheval sur le quadrillé, (ju<i ceux qui sont à cheval sur les trails limitant le carré à gauclic el fn bas, négligeant ceux qui correspondent aux traits supérieur et droil.

On connaît ainsi !e nombre de L'Ioliulus contenus dans un cube d'un cinquième de millimètre de côté.

Oimme, dans un millimètre cube, il y a V2T) cubes semblables, il faudrii iriiiHiplicr le chiffre obtenu par I2Ô : •Tilln, il s'iigit d'une dilution à 2 p.i>00 !tii|iii)ue.(iit-iiiiiUnitirt' du Huyiîrii.) ou, plus exactement, à 2 p. 490, en Icnunt compte du liquide perdu par II' nnmillap; des pipelles (1 millimétrés cubes environ). Il faudra donc nnilliplier le résultat d'abord par 125, puis par le Utre de la dilution, soit 2 18 ; ou, plus simplement, multiplier le résultat par le chiffre 31 000.

îi

sk*t

Pour faire une numération exacte, on déplace la lame-celIule et l'on recompte en un autre point les globules contenus dans le carré. On compte ainsi plusieurs carrés. On additionne les chiffres trouvés, on multiplie par 31 000 ce total et l'on divise par le nombre de carrés comptés.

Si l'on prenait du sang jusqu'au trait 4,5 ou 2,5 de la pipette, on ferait les corrections en raisonnant d'après la théorie de l'appareil.

Numération des globules blancs. — Pour la numération des leucocytes, on déplace la lame-cellule, d'abord de droite à gauche, par exemple, en l'avançant chaque fois d'une longueur égale à la largeur du carré, et l'on note chaque fois la numération en notant aussi bien les résultats négatifs que les positifs. On arrive ainsi à compter tous les leucocytes se trouvant suivant le diamètre transversal de la goutte. Puis on agit de même dans le sens antéro-postérieur. On arrive ainsi à compter au moins f)0 carrés. On additionne les leucocytes trouvés, on divise par le nombre de carrés comptés et l'on multiplie par 31 000.

Nombre normal des éléments flg^nrés du sang.

Normalement :

li i-i^K.,i«c../M,r»oc i 5 000 000 chez l'homme I par milUmètrc cube

j Globules rouges ( 4 500 000 chez la femme ( de sang.

Globules blancs = 5 à 10 000 par millimètre cube de sang.

Dosage de V hémoglobine. — On se sert d'appareils utilisant les propriétés tinctoriales de l'oxyhémoglobine, appareils désignés sous le nom d'hémochromomètres ou hémoglobinomètres.

I. Hémochromomètre de Hayem. — Cet appareil se compose : 1*^ de deux petits réservoirs de verre, soudés l'un près de l'autre sur une lame de verre polie, et pouvant contenir chacun un demi-centimètre cube d'eau ; 2^ d'un cahier contenant des rondelles coloriées de plus en plus foncées qu'on fait passer sous le réservoir contenant de l'eau.

On place une égale quantité d'eau dans chaque réservoir (un demicentimètre cube), puis, avec la pipette de l'hématimètre de Hayem, on dépose 2 à 4 millimètres cubes de sang dans l'un des réservoirs ; on fait y lors passer successivement la série des teintes coloriées sous la cellule qui ne contient que de l'eau pure et l'on s'arrête quand les teintes sont identiques dans Fitr. ':.*01. — Colorimèlre de Hayem.

les deux réservoirs (fig. 291). On

îic reporte alors à la table de Hayem qui établit ce que représente en hématies, ayant une valeur normale en hémoglobine (0,90 à 1 p. 100), chaque rondelle coloriée. La teinte n^ 1 correspond à 8 649 000 globules rouges normaux ; la teinte n^ 2 à 9 720 125 globules normaux, etc. On divise ce nombre de globules correspondant à la teinte trouvée par le chiffre de millimètres cubes de sang employé. On obtient ainsi la ri-

t22 EXAMEN DE V APPAREIL CIRCULATOIRE

chesse globulaire R pour 1 millimètre cube de sang, évaluée en globules normaux.

En divisant ce chiffre R par le nombre des globules rouges N dont la numération a été faite préalablement chez le même sujet, on obtient la valeur globulaire G, c'est-à-dire la valeur individuelle d'un globule du sang examiné.

II. Échelle chromométrique de Tallqvist. — Cette échelle chromométrique est formée d'une série de papiers colorés, de dix nuances différentes. Le papier le plus pâle représente la couleur d'un sang contenant 10 p. 100 d'hémoglobin«\ Les papiers colorés sont percés en leur centre d'un trou, à travers lequel on regardera la tache de sang.

/Tjoff.^y/j- ^S^**"*^™' La goutte de sang obtenue par

Fig.292. — HémoglobinimètredeTallqvisl. piqûre au doigt est recueillie sur

une feuille de papier buvard blanc; elle doit s'élendre spontanément, être complètement bue par le papier, et donner une tache de 5 à G millimètres de diamètre. L'examen se fait à un éclairage tombant d'en haut, toujours à la lumière du jour. Dès que la tache a perdu son éclat humide, on plie en deux le papier buvard et on la compare aux papiers colorés (fifr. l'92).

Préparation de sang sec. ■ — Élalemeni. — On se sert de lames et lamelles, de préférence rodées sur leurs bords et bien planes ; elles seront bien nettoyées et déirraissées par un lavage à l'alcool à 90" ou à l'éther sulfurique, et essuyées encore humides avec un linpre lin non filamenteux.

On prend une lame rodée, dont on applique l'extrémité sur la goutte de sang ol)tenue [)ar piqûre du doigt, en évitant de toucher la pulpe du doigt ; [>uis, avec le bord rodé dune autre lame, on exécute d'abord rapidement quelques petits mouvements transversaux, pour que le sang s'étale sur toute la largeur de la lame ; puis, en appuyant moyennement, on étale la goutte horizontalement sur la lame, d'un seul coup. On agite ensuite fortement pour obtenir une dessiccation rapide.

Fixaiion. — On emploie l'un des moyens indiqués à propos des techniques bactériologiques.

Coloralion. -- On fera en général trois colorations:

lo A la thionine, après fixation à Talcooi ou à l'acide chromique ;

2° A l'hématéine-éosine aqueuse, après fixation à l'alcool-éther ;

3" Au Giemsa, après fixation au formol ou à l'alcool absolu pendant trente minutes.

Dans certains cas, on pourra ajouter une coloration au triacided'Ehrlich (par exemple dans les leucémies).

Pour les formules de colorants et les détails de la méthode de coloration, nous renvoyons à la Technique haclériologique.

NUMÉRATION DES DIFFÉRENTES VARIÉTÉS DE GLOBULES BLANCS (Formule leucocytaire). — 11 est souvent indispensable aujourd'hui

EXAMEN DU SAMG 223

de pri.lii|Mpr !■■ jiKiin-fiiLage des dilTércnk-s espèces de leucoeylps, en un mot d'i'fablir la funmile ieueorytaire, car, dans cerlains cas pathologiques, on trouve un nomlire total de leucocytes absoUiment nomifil.mais avec aiignieidation du iinmlire des lymphocytes ou des c'osinophilfs, par e.\omii|i-. [liir raii[nirf aux autres varii'tés leucocytaire».

IXIe riiiiiirralinn >r fuit sur des pri^pa rations sèches colonies. On

Cinq petils ot moyens moiionucléairea [lymphocytes} ;

Des polynucléaires;

Deux éosino pli îles iJont l'un a ics granule lions esaaimfes ;

Des globules rouges dont quelques-uns sont crtncli^s par v .Des h éma lob In s tes csrscLérisi^s par un certain nombre rfunis en plaquettes (ils rormenl trois groupes).

N. B. — Dans cette ligure, le nombre des leucocytes n'est pus du tout proportionné BU nombre des globules rouges, puisqu'ils Boni uormiilcnieut lions la proportion de I p. lOUO. — Nous avons groupé ici tous les 6K'meuls du sang.

emploie un objectif à sec 12, ou, le plus souvent, un objectif à immersion i l'huile de cèdre 1/12 ou 1/16, avec un oculaire 2 ou 4. 11 est commode d'adapter sur la platine du microscope un petit chariot porte-laine, mobile danslesensanléro-postérieur et dans le sens latéral, au moyen de molettes de rappel. Une graduation dans les deux sens permet de retrouver rapi- >4ement sur une préparation un point particulier.

Dans le eus de leucémie, si le nombre des leucncytea pour chaque

224 EXAMEN DE L'APPATiEIL CIRCVLATOIRE ^Ê

champ (11' microscope est considérable, il est commode d'employer UM oculaire quadrillé. fl

Dans ce pourcentage, on se contente le plus souvent de compter lefl polynucléaires, les lymphocytes, les grands mononucléaires, les éosin^J philes {fig. 293). 1

Sur une feuille de papier, on fait un taMeau réservani une colonne pouq

chaque espèce. 1

rolyri. I LympJi. | Gros monon. | Eosin. I

On déplace régulièrement la préparation dau.s ses divers j^ens en évîLain les zones peu distinctes, mal fixées ou mal colorées, et en faisant en sorti de ne pas compter deux fois les mêmes leucocytes, .\u fur et à mesufl qu'on voit un leucocyte, on l'inscrit dans sa colonne respective. ^

Il faut compter au moins 300 leucocytes, ou mieux 500 pour avoir on résultai encore plus précis. I

On additionne alors chaque colonne. Puis on divise chaque total parX si l'on a compté 300 leucocytes ou par 5 si on en a compté 500 ; on AI ainsi le pourcentage. V

Les mastzellen, les différentes espèces de myélocytes, les plasma zellen, |iil cellules de Tûrk doivent, lorsqu'elles existent, être comptées séparément?

Quant aux hématies nucléées, on les compte également séparément, en détaillant, si l'on veut, suivant leur caractère : mégaloblastes ou normoblastes. Si, par exemple, en comptant 300 leucocytes, on a trouvé 12 hématies nucléées, on dira qu'il y a 4 p. 100 d'hématies nudéées.

On peut, par exemple, pour un pourcentage ilétaillé, dresser le taMeau suivant :

Nor- I Miga- 1 Myè- 1 Neu- [ Bos. | Basa- 1 Lym- 1 Mono 1 Formes 1 Pins-

mobl. lobl. loc. tr. ph. pno. de pas- maz.

I I I I I I I I sage. I

Quand on veut avoir un pourcentage exact des variétés leucocytai très peu abondantes, comme les ptasmazellen, les mastzellen, compter 1 000 leucocytes.

Formula

iBucocytalra normals.

fô â 70 p. 100

— basophlles....

(àlype de moslzelien)

MononucliaTes ( , en général. \ ^'i '•> '^'^ P-

Lymphocyles vrais (petits el grands)

toldes (Je Pnppenheim

Pappenheitn (grands mono el lype de transition d'Ehrfich)

Figure neutrophile d'Arneth. — On compte 100 polynucléaires I neutrophites en les classant suivant le nombre de leurs noyaux ; 1,2,3,4, 5. )rmalement on a : ît polynucléaires à 1 noyau.

— 35 polynucléaires à 2 noyaux.

— 41 polynucléaires à 3 noyaux.

— 17 polynucléaires à 4 noyaux.

— 2 polynucléaires à 5 noyaux.