KO; 268 D

Et si l'on admet un seul atome de fer dans la molécule de l’hémoglobine, le poids moléculaire total deviendrait 16 669 et la formule elle-même,

C H N S Fe O 758 1203 195 3 218

La grandeur moléculaire de l’hémoglobine de bœuf serait la même, d’après HürNEr. Pour l’hémoglobine de poule, le rapport du fer au soufre étant

56 __. 0,3353 COIN SSSE x = 4,485

Il faut donc ici doubler le nombre d’atomes de fer, ce qui produit le rapport

et conduit à une grandeur moléculaire double de la précédente. Pour l’hémoglobine de cheval au contraire, le rapport à devient ue et la grandeur 2, moléculaire sensiblement égale à celle de l’hémoglobine de chien.

D’après ces résultats, il semble que, d’une espèce animale à l’autre, il existe une constance remarquable de la proportion de fer contenue dans la molécule, tandis que le soufre varie considérablement.

Comme on le verra plus loin, on admet que l'hémoglobine est constituée par l'union d’un noyau coloré, l’hémochromogène, à une substance albuminoïde, la globine. Le fer est contenu exclusivement dans le premier de ces fragments, le soufre dans le second.

La constance remarquable de la teneur en fer des échantillons d’hémoglobine provenant de différents mammifères et d’un oiseau indique que la proportion d’hémochromogène {c’est-à-dire du groupe spécifiquement actif de l’hémoglobine) contenue dans la molécule d’hémoglobine des divers animaux est constante. La composition chimique de cet hémochromogène est d’ailleurs constante, quelle que soit son origine.

Au contraire, le noyau albuminoïde, s’il est constant dans sa masse, semble différer dans sa qualité d’une espèce animale à l’autre, ainsi que l’indique sa teneur variable en soufre.

Un autre moyen purement chimique de calculer la grandeur moléculaire de la molécule d’hémoglobine est donné par l’étude quantitative de sa combinaison avec les différents gaz.

Si l’on admet la formule de dissociation de Hürner, on est amené à conclure, ainsi qu’il a été dit plus haut, que l’hémoglobine et l’oxygène se combinent molécule à molécules, et il en serait d’ailleurs de même pour l’oxyde de carbone, puisque ces gaz se remplacent en quantité volumétriquement équivalente (Lornar MEYER) dans leur combinaison avec l’hémoglobine. se

Or, pour une grandeur moléculaire (calculée d’après les analyses précédentes) de l’hémoglobine de bœuf, égale à 16669, la quantité d'oxyde de carbone combinée à un gramme d’hémoglobine serait, d’après HüÜrNER (8),

æ 28 A1 — 16669 x — 0.001679 gr. de CO

c'est-à-dire à 0° et 760 millimètres de pression, 1°°,34; et le chiffre trouvé directement

par cet auteur est, comme il a été dit plus haut, — 1°°,338.

En 1905, Rein (199) a procédé à une mesure directe de la pression osmotique de solutions pures de l’hémoglobine du chien. La valeur très constante qu'il observa conduit à une grandeur moléculaire triple de celle de la formule de JaQuer.

Hüener et Gannser (202) ont repris ces mesures dans des conditions sensiblement analogues à celles du physiologiste anglais. Seulement leurs résultats, très différents des siens, concordent au contraire admirablement avec d’autres données de Hürwer. Ils permettent d'évaluer à 15115 la grandeur moléculaire de l'hémoglobine de cheval, à 16321 celle de bœuf.

Si l’on accepte les chiffres de HürNER, on en peut conclure :

{° Que le poids moléculaire moyen de l’hémoglobine des mammifères est compris entre 15 000 et 17 000 ;

20 Que la molécule contient un atome de fer, soit une molécule de chromogène ;

3° Que l’hémoglobine et l'oxygène s’unissent molécule à molécule.

HüeNER avait constaté, d'autre part, l’identité d’une des constantes photomé-

triques — de l’hémoglobine de divers mammifères (porc, lapin, bœuf). Il est remarquable €o

de constater {si l’on s’en tient aux résultats de HürNER) que, tandis que l'étude des propriétés spécifiques de l’hémoglobine, de celles qui dépendent de la molécule envisagée dans son ensemble {propriétés optiques, capacité pour les gaz) conduit à l’hypothèse de l'identité de l’hémoglobine des différentes espèces, au contraire, la teneur en soufre, c’est-à-dire une propriété relevant du noyau albuminoïde de la molécule, tend à faire supposer que, d’une espèce à l’autre, l’hémoglobine est chimiquement différente.

Si les résultats qui mettent en lumière ces analogies et ces dissemblances sont exacts, il faudrait bien conclure que les variations de la composition chimique du noyau albuminoïde de la molécule d’hémoglobine n'influencent en rien les qualités optiques de celle-ci, n1 la plus importante de ses propriétés chimiques, la capacité pour les gaz. Celles-ci seraient fonction exclusive et inaltérable du noyau chromogène, invariable lui-même.

D’autres caractères physiques et chimiques de l’hémoglobine de divers vertébrés, tels que la composition centésimale, la forme cristalline, l'eau de cristallisation, la solubilité dans l’eau, ont été trouvées différentes d’une espèce à l’autre. Mais il règne trop de confusion dans les données souvent contradictoires des auteurs ; celles-ci possèdent, en tout cas, trop peu de précision pour faire de ces variations des preuves nouvelles de la pluralité des hémoglobines.

Il à été dit plus haut que JouiN, ayant dressé la courbe de dissociation de l’oxyhémoglobine de cobaye et d’oie, trouve pour l’hémoglobine de cobaye un graphique comparable à celui de l’hémoglobine de chien, tandis que celui de l’oie présente une ascension beaucoup plus inclinée.

L’oxyhémoglobine est transformée par l’oxyde de carbone en hémoglobine oxycarbonée, par l’oxyde nitrique en hémoglobine oxynitrique; combinaisons qui seront étudiées en détail dans des chapitres spéciaux (Voir p. 351).

Il a été dit plus haut que, chauffée en solution aqueuse à 60-70, l'hémoglobine se décompose en hématine et globine.

À la température ordinaire, de faibles quantités d'acides minéraux ou de bases fortes lui font subir la même décomposition.

Quand la quantité d’acide est très peu considérable, ou si l'acide employé est faible, la première modification observée est la combinaison plus stable avec l'oxygène. It y à longtemps que Lornar Meyer avait constaté que l'addition d'acide tartrique au sang diminuait des 4/5 la quantité d'oxygène cédée au vide. Et ilest intéressant de faire remarquer ici que, d'après Horpe-SeyLer, celte transformation serait effectuée à la longue par l'acide carbonique lui-même. On a considéré cette transformation de l’oxyhémoglobine sous l'influence d’acides faibles, comme étant identique à celle qu’elle subit par l’action des agents oxydants, aboutissant à la méthémoglobine.

D'après Harnack (49), l’oxyhémoglobine, la sulfhémoglobine soumises à l’action des acides faibles (même l’acide carbonique) ou des acides forts très dilués, se transforment en une substance très instable, que l’on a confondue jusqu'ici avec la méthémoglobine, qu'elle rappelle par la coloration brune de ses solutions. La bande d'absorption qu’elle

présente est située à droite de celle de la méthémoglobine (voir plus loin). Comme l’oxyhémoglobine, l’acidhémoglobine présente deux bandes d'absorption dans le vert.

L’acidhémoglobine possède une grande tendance à se scinder en hématine et globine. Les alcalis ne transforment pas l’acidhémoglobine en hémoglobine réduite. Le cyanure de potassium rend aux solutions brunes d’acidhémoglobine la coloration rouge et un spectre très analogue à celui de l’oxyhémoglobine, qui se transforme ultérieurement en un autre rappelant celui de l’hémoglobine réduite. Mais, en raison de la ressemblance de ces spectres avec ceux de la méthémoglobine cyanée, HARNACK réserve son opinion sur le véritable état du pigment sanguin dans ces solutions.

Sous l'influence des agents oxydants les plus divers, tels que l’ozone (coloration brune des bords du filtre au travers duquel passe une solution d’hémoglobine), l’iode, les permanganates, les nitrites, les ferri-cyanures alcalins, l’oxyhémoglobine se transforme en une substance nouvelle, la méthémoglobine, caractérisée par la stabilité de sa combinaison avec l’oxygène, et qui sera étudiée plus loin. D’après HoPps-SEYLER, les

nitrates, les chlorates n’agiraient pas en solution neutre. La même transformation serait :

opérée par des agents réducteurs tels qu'hydrogène naissant, hydrogène fixé sur palladium, putréfaction à l’abri de l'air, pyrogallol, allantoïne, hydroquinone, etc., ou par des substances très diverses, telles que l’aniline, la toluidine, l’acétanilide, la glycérine, l’acétophénitidine, ete.

Cette altération se fait déjà à l’air, et, à la longue, toutes les préparations sèches d’oxyhémoglobine se transforment progressivement en méthémoglobine.

Additionnée d’eau oxygénée, une solution d’oxyhémoglobine ne produit pas de dégagement d'oxygène, si l’hémoglobine est complètement pure. Si le dégagement s’effectue, il est très faible, et l’hémoglobine est oxydée elle-même par l’oxygène naissant, tandis que le sang complet ou une dissolution fraîche d’hématies produisent rapidement le même phénomène, sans que la matière colorante subisse la moindre transformation.

On observe la même différence dans la facon de se comporter des deux liquides visà-vis d’un mélange de teinture de gaïac et de térébenthine ozonisée. Ce mélange est bleui rapidement |par oxydation de la résine de gaïac?), sous l’influence des solutions non cristallisées, et n’est pas influencé par l’hémoglobine pure.

BERGENGRUEN (50) a démontré pour l’action de l’eau oxygénée que la partie active dans le globule, c’est non l’hémoglobine, mais le stroma, et cette propriété du stroma lui est commune à lui et à tous les protoplasmas cellulaires. On peut appliquer la même explication au bleuissement de la teinture de gaïac.

L’oxyhémoglobine se comporte vis-à-vis du papier de tournesol comme un acide bien caractérisé (Küune, PReYER), tandis que le caractère acide de l’hémoglobine réduite est beaucoup moins accusé.

Des solutions d’oxyhémoglobine additionnées de carbonates alcalins neutres abandonnent de l’acide carbonique au vide (PREYER).

Soumises à l’action du courant galvanique, les solutions d’oxyhémoglobine laissent déposer des cristaux au pôle positif (A. Scamivr, Rozzer). L’oxyhémoglobine est donc un colloïde électro-négatif.

Des solutions d’oxyhémoglobine additionnées de cyanure de mercure dégagent de l'acide cyanhydrique, qu’il est facile de mettre en évidence en couvrant le vase par un verre de montre mouillé à sa surface inférieure d’une goutte de nitrate d'argent. Celle-ci se trouble par suite de la formation de cyanure d’argent (MicHaeLis et COHNSTEIN) (51). .

Ces différents faits permettent de considérer l’oxyhémoglobine comme une substance albuminoïde faiblement acide.

La trypsine attaque l’oxyhémoglobine et peptonise la partie albuminoïde de sa molécule, en même temps qu’est mise en liberté l’hématine. La même trypsine ne possède aucune action destructive sur l’hémoglobine réduite (Hoppr-SEYLER).

La séparation entre les deux noyaux constitutifs de l’oxyhémoglobine, du noyau albuminoïde et du noyau ferrifère s’opère {rès facilement. Déjà, à la température de coagulation de l’oxyhémoglobine par la chaleur, le dédoublement commence à s’opérer en

milieu neutre. A froid, les acides et les bases fortes en concentration faible le provoquent rapidement.

Cette décomposition parles acides a été étudiée d’une façon approfondie dans ces derniers temps par plusieurs auteurs (Pour l'historique voir un article de Morocaowerz (51).)

Scauzz (57) considère l’oxyhémoglobine comme constituée par l’union d’une substance albuminoïde spéciale, la globine, et d’un noyau ferrifère, l’hématine. La globine serait une substance albuminoïde très rapprochée de celles que Kossez a désignées sous le nom générique d’histones, et qui se caractérisent par leurs propriétés basiques et leur forte teneur en bases hexoniques. Elle est insoluble dans l’eau, soluble dans les solutions’ acides ou alcalinisées par la potasse ou la soude, non par l’ammoniaque. L’acide nitrique la précipite, mais le précipité se redissout à chaud. L'alcool à volume égal la précipite, le précipité est soluble à chaud (Lawrow). Le chlorure sodique et le sulfate ammonique à saturation la précipitent en solution acide ou neutre. La globine contiendrait la même quantité de soufre que l'hémoglobine, et dans les deux substances la moitié du soufre serait contenue à l’état labile, c’est-à-dire apte à être détachée à l’état de sulfure par l’ébullition avec une base forte, l’autre moitié à l’état stabile. ScauLz réussit à obtenir de 100 parties d’oxyhémoglobine 86.5 de globine, et 4.2 d’hé- Matine, avec un résidu non déterminé. Lawrow (52) recueillit jusqu’à 94.09 p. 100 de globine, et 4.47 d’'hématine avec un résidu faible contenant de l’ammoniaque et des * acides gras.

La destruction totale de l’hémoglobine de cheval fournit à PRÔSCHER (53) 41.7 p. 100 de leucine, 1.52 p. 100 de tyrosine, 0.195 p. 100 d'acide aspartique, 0.011 p. 100 d'acide glutamique, une quantité notable de substances précipitées par l'acide phosphotungstique, constituant probablement un mélange de bases hexoniques. Lawrow (52\ obtint récemment, après hydrolyse par l’acide chlorhydrique de 317 grammes d'oxyhémoglobine de cheval, un mélange des trois bases hexoniques, pesant ensemble environ 65 grammes. c’est-à-dire 20.4 p. 100, dont 12.4 p. 100 d’histidine. Haussmann (54) détermina, après destruction de l’hémoglobine par les acides, quelle est la quantité d'azote qui se dégage à l’état d’ammoniaque (azote amidé), quelle fraction se trouve contenue dans le précipité phosphotungstique (azote diaminé), et l’azote non précipitable (azote monoaminé). Il trouva pour le premier, 1.07 p. 100; pour le second, 4.07 p. 100 ; pour le troisième, 10.95 p. 100, l'azote total constituant 17.31 p. 100 du poids total de la molécule, c’est-à-dire une proportion dominante des acides monoaminés, ce qui est -en plein accord avec la grande quantité de leucine trouvée par PRÔSCHER,

Nos connaissances les plus complètes et les plus récentes sur celte question sont fournies par un travail d'ABDERHALDEN (55), continuation des premières recherches de -cet auteur en collaboration avec Eu. Fiscrer.

A côté des substances déjà nommées, il faut encore citer comme, se produisant pendant l’hydrolyse de l’oxyhémoglobine par les acides : l’alanine, la PETER ESS l'acide «-pyrrolidin-carbonique, la cystine, la sérine, le tryptophane.

Rapportés à 100 grammes de globine, les différents produits cristalloiïdes se trouvent -dans les proportions suivantes :

Alanine, 4.19 gr.; leucine, 29.04 gr.; ac. «-pyrrolidin-carbonique, 2.34 gr. ; phénylalanine, 4.24 gr.; ac. glutamique, 1.73 gr.; ac. aspartique, 4.43 gr.; cystine, 0.31 gr. ; sérine, 0.56 gr. ; ac. oxy rome carbonique,1.04 gr.; tyrosine, 1.33 gr.; lysine,4.28 or. ; histidine, 10.96 gr.; arginine, 5.24 gr.

Le dosage des acides monoaminés de l’hémoglobine de chien fournit les quantités suivantes, rapportées à 100 grammes de globine : glycocolle, traces dues peut-être à : des impuretés ; alanine, 3 grammes; valine, À gramme ; leucine, 18.2 grammes ; pro- Jine, 4.5 grammes ; acide asparlique, 2.5 grammes; acide glutamique, 1.2 grammes; phénylalanine, 5 grammes (ABDERHALDEN, et BAUMANN (56).)

En ce qui concerne le mode d’union des deux radicaux constitutifs de l’oxyhémoglobine, Hürner (56) admet, à la suite de Hoprpg-SeyLer, que la soudure se fait probablement par l'intermédiaire d’un ou plusieurs atomes d’oxygène, comme semble le prouver l’action dissociante d’un agent réducteur employé en excès, l’hydrate d’hydrazine.

Divers essais de synthèse de l’oxyhémoglobine au moyen des deux fragments de la molécule que sépare l’analyse, ont été tentés. PREyEr (57) a prétendu, à propos d’une publication de Berri Sans et Moïressier (58) (1897), qu'il avait déjà réussi et décrit celte synthèse en 1871.

Les auteurs français disent avoir obtenu la reconstitution en solution alcaline de la molécule de méthémoglobine aux dépens d’hématine et de l’acidalbumine provenant: du clivage de l’oxyhémoglobine. Leurs résultats ont été mis en doute par Nencriet ZLALESKI.

Recherche de l’oxyhémoglobine. — Pour caractériser dans un liquide la présence: de l'hémoglobine, c’est aux propriétés spectroscopiques de cette substance qu’il faudra. s'adresser de préférence. |

Pour séparer les hémoglobines oxygénée et réduile d’autres pigments dérivés qui peuvent leur être mélangés (méthémoglobine, hématine, hématoporphyrine),on procède: habituellement à la précipitation de ces derniers par l’acétate de plomb{éviter un excès). avec filtration rapide consécutive. Ce traitement entraînera à l’occasion d’autres sub-— stances colorantes qui pourraient gêner l’observation spectroscopique.

La transformalion du spectre de l’oxyhémoglobine en hémoglobine réduite ou en hémoglobine oxycarbonée, la stabilité de cette dernière vis-à-vis des agents réducteurs, l'obtention d'hémochromogène ou d’hémochromogène oxycarboné par l’action de fortes concentrations alcalines sur les hémoglobines réduite ou oxycarbonée, l’action des acides forts qui produisent de l’hématoporphyrine sont des preuves très caractéristiques et très certaines de l’existence de l’hémoglobine dans les solutions qui les présentent.

Méthodes de dosage de l’oxyhémoglobine. — La recherche et le dosage de l'oxyhémoglobine ou de ses dérivés caractéristiques sont fondés sur les propriétés chimiques et physiques de ces substances. L'étude des divers procédés qualitatifs trouvera mieux sa place au chapitre traitant de la recherche médico-légale du sang. Seules les méthodes de dosage quantitatif de l’hémoglobine seront exposées ici.

Parmi les méthodes chimiques, les plus importantes sont :

1° Le dosage du fér. — Ou calcine l’hémoglobine sèche, ou le sang desséché. Les cendres sont reprises par l'acide chlorhydrique, réduites par le zinc et titrées par une solution de permanganate. En multipliant le chiffre exprimant le poids de fer par le

FR on obtient la quantité d’oxyhémoglobine.

Cette multiplication par un facteur aussi considérable (300) est un sérieux inconvénient de la méthode, qui exige d’ailleurs, pour être exacte, des quantités notables de substance. Elle a été appropriée récemment aux besoins de la clinique par Jocres (59). | (Voir au sujet de cette méthode HLanir (60).)

2° Dosage de l'hématine : BRozZEIT (61) a proposé de peser l’hématine obtenue par décomposition de l’hémoglobine par l’acide chlorhydrique dilué. Le liquide est additionné d'acide chlorhydrique et d’éther.

On agite vigoureusement pendant quelques instants et on introduit goutte à goutte de l'alcool dans le mélange, jusqu’à ce qu'il se sépare en deux couches, l’une supérieure, éthérée, colorée en brun par l’hématine; l’autre inférieure, incolore ou jaune clair.

La solution éthérée, agitée avec une solution diluée d’ammoniaque, lui abandonne l’'hématine, qui est pesée après évaporation.

L'auteur ne donne pas de preuves suffisantes de la pureté de ce produit, et l’extraction par l’éther n’est pas complète (Rasewsky) (62).

QuinquauD a proposé le procédé suivant de décolorimétrie. L’eau de chlore détruit l'hémoglobine en la faisant passer par le jaune, le jaune-vert jusqu’au vert-gris. Pour amener À gramme d’oxyhémoglobine à cette teinte, il faut une quantité donnée d’une solution titrée d’eau de chlore. D'où la possibilité de déterminer la quantité d’oxyhémoglobine se trouvant dans un liquide. La méthode est inexacte à différents titres et. non recommandable.

Dosage de l’oxygène ou de l’oxyde de carbone absorbé. — a) Méthodes physiques. — Comme il a été dit plus haut, ce dosage peut se faire de diverses facons. On peut. extraire du sang l’oxygène qu'il contient, après agitation à l'air prolongée pendant quinze minutes et centrifugation pour se débarrasser de l’écume et des bulles de gaz, ou mesurer la quantité d'oxygène enlevée par la solution, après réduction complète de celle-ci, à une atmosphère de volume et de composition déterminés, en tenant compte de la fraction gazeuse simplement dissoute. On peut enfin déterminer, comme le fait GRÉHANT, la quantité d'oxygène que le sang abandonne sous l’action d’un excès

coefficient

d’oxyde de carbone. La première méthode ne serait applicable qu'au sang lui-même, puisque, ainsi qu’il a été dit, le vide n’enlève pas aux solutions pures d’oxyhémoglobine tout leur oxygène. De pius l’oxygène peut entrer en combinaison avec d’autres éléments dissous dans le liquide, ce qui rend préférable dans des études d’absorptiométrie l'emploi de l’oxyde de carbone (Hürner). Mais cette méthode est d’un maniement difficile : elle nécessite des appareils spéciaux, compliqués, et les grands écarts qui règnent entre les résultats des auteurs qui ont établi la capacité de l’hémoglobine pour ce gaz, ne sont pas faits pour encourager à suivre cette voie.

Si l’on s’y résolvait, il faudrait employer le facteur de Hürner, d’après lequel à { gramme d’hémoglobine correspond 1°°,338 de gaz.

b) Méthode chimique. — SonüTzENBERGER et RISLER, suivis par LauBLixG (24), ont déterminé par titration directe au moyen d’une solution d’hydrosulfite de soude la quantité d'oxygène qui se trouve en combinaison labile avec l’hémoglobine. D’après cette méthode, LamBzinG obtint des chiffres notablement plus élevés que ceux que l’on est en droit de considérer actuellement comme répondant à la réalité. Il serait hasardé, dans ces conditions, de recourir à cette méthode.

Méthodes optiques. — Celles-ci comprennent des méthodes basées sur l'intensité du pouvoir colorant de la solution, méthodes colorimétriques, d’autres fondées sur l’appréciation de la quantité de lumière absorbée par la solution. Parmi ces dernières, se range la spectrophotométrie.

Dans la méthode colorimétrique, on dilue progressivement le sang ou le liquide contenant de l’hémoglobine par des additions successives de quantités mesurées d’eau distillée, jusqu’à ce que la coloration soit devenue égale à celle d’un étalon. Cet étalon sera, soit une dilution à titre connu de sang normal, soit une solution d’une substance colorante, telle que le picrocarmin, dont la teinte et le spectre sont très rapprochés de ceux de l’oxyhémoglobine, soit un verre coloré.

Au lieu de diluer progressivement la. liqueur, on peut faire varier son pouvoir colorant en l’examinant sous différentes épaisseurs, ce qui s’obtiendra par exemple en l’introduisant dans un vase prismatique à base triangulaire allongée, que l’on déplacera latéralement devant l’œil. On détermine alors quelle est l’épaisseur de solution qui possède le même pouvoir colorant que l’étalon. Enfin l’opération peut être inverse, c'est-à-dire que ce sera l’étalon dont l’épaisseur sera variable.

Les différents appareils et procédés, aussi nombreux que les auteurs qui se sont occupés du dosage de l'hémoglobine par voie colorimétrique, reviennent à l’un ou l’autre de ces types. Seuls, les plus connus seront décrits ici succinctement :

Procédé de F. Hoppe-Seyler. Hématinomètre. — Le procédé primitif de Hopre-SEYLER consistait à comparer le pouvoir colorant de deux solutions introduites dans deux cuves. adjacentes de verre, à faces parallèles, d’une épaisseur de 1 centimètre. L’une des cuves contenait une solution pure d'hémoglobine de titre connu, dans l’autre était introduit un volume connu de la liqueur étudiée. On ajoutait à cette dernière des quantités mesurées d'eau distillée jusqu’à égalité de teinte. La comparaison se faisait par réflexion sur fond blanc (feuille de papier blanc placée derrière les cuves).

Le grand inconvénient de la méthode, c’est la difficulté de se procurer une solution élalon de titre exact, solution qui s’altère d’ailleurs très rapidement.

Pour obvier à ce défaut, Rasewsky (62), élève de HoPpe-SEYLER, proposa de remplacer la solution titrée d’oxyhémoglobine par une solution ammoniacale de picrocarmin.

Procédé de l'échelle liquide. — Wezcker (1854) fait extemporanément avec du sang normal une série de dilutions à titres différents auxquelles il compare la solution, dont la teneur doit être déterminée. Cette méthode est tout au plus approximative, en raison: même du manque de précision dans la confection des tubes étalons.

Quincre (1878) remplace les tubes de sang normal dilué par des solutions de picro-carmin de concentration variée, introduites dans vingt tubes thermométriques fixés sur un cadre de carton. La comparaison se fait sur fond blanc.

Procédé de Hayem (63). — Haven emploie un appareil composé de deux anneaux de verre de même diamètre, à surface extérieure dépolie, collés côte à côte sur une plaque de verre. Ils ont été usés au niveau des points tangents, de façon à former deux petits réservoirs identiques, séparés par une mince cloison et pouvant contenir chacun un peu

346 HÉMOCGLOBINE.

plus de 500 millimètres cubes d’eau. On introduit cette quantité d’eau dans chaque cellule, et dans l’une d’elles on ajoute 2 à 15 millimètres cubes du sang à examiner. Sous l’autre cellule, on glisse une à une des rondelles de papier teintes à l’aquarelle en tons roses de plus en plus foncés. Chaque rondelle correspond à une teneur en hémoglobine déterminée d’après les dilutions successives d’un sang dont on connaît le nombre de globules. Le procédé de Haye est destiné aux recherches de clinique.

Procédé de Jolyet et Laffont (64). — Ces auteurs proposèrent l’emploi du colorimètre de LaurenT-DuBosQ modifié comme suit : au lieu d’une solution étalon introduite dans , l’une des cuvettes, ils proposent l’emploi d’une plaque de verre rouge, dont la valeur colorante est établie par comparaison avec des solutions titrées d’oxyhémoglobine. On détermine l’épaisseur d’une solution de sang à 1/25, dont le pouvoir colorant équivaut à celui de la plaque de verre,

En raison de la difficulté de se procurer des verres de coloration bien déterminée, Mazassez a proposé de remplacer la plaque de verre par une solution phéniquée neutre de picrocarmin dans de la glycérine aux 3/4.

Mais Laugzie objecte l’altérabilité de cette dernière et préfère l’étalon de Joxer et LarronT. D’après les recherches de cet auteur, les résultats de cette méthode sont très satisfaisants.

Procédé de Malassez (65). — L’hémochromomètre se compose d’une plaque rectangulaire horizontale pouvant être inclinée plus ou moins sur un pied. Elle est percée de deux trous circulaires adjacents de 5 millimètres de diamètre, situés dans un même grand diamètre. Derrière l’un des trous est fixé l’étalon, derrière l’autre se meut une cuve prismatique de verre, contenant la solution à examiner. On détermine l’épaisseur de celle-ci, qui équivaut à l'étalon. Une lecture directe donne immédiatement la quantité d’hémoglobine correspondant à cette épaisseur.

L'éclairage se fait par lumière diffuse du ciel réfléchie au travers d’une glace dépolie. L'appareil de MaLassez, très commode, doune la teneur en hémoglobine à 2,5 p. 100 près. :

Hémoglobinomètre de Gowers (66). — L'appareil se compose de deux tubes en verre fixés dans un support commun. L'un, le tube étalon, scellé, est rempli de glycérine picrocarminée dont la teinte correspond à du sang normal au 100.

L'autre est divisé en 100 divisions valant chacune 20 millimètres cubes. Dans une pipette capillaire tenant 20 millimètres cubes, on aspire une gouttelette de sang de facon à la remplir exactement, et l’on souffle ces 20 millimètres cubes de sang dans le tube gradué, pourvu au préalable d’un peu d’eau distillée. Par addition successive d’eau, on tâche d’atteindre dans ce tube l’égalité de teinte avec le tube étalon.

Ce procédé donnerait à l’observateur expérimenté la valeur exacte à 2 ou 3 p. 100 près.

Hémomètre de von Fleischl (67). — Dans cet instrument, la dilution sanguine est mise en regard d’un prisme de verre rouge que l’on déplace. Une lecture directe indique la teneur d’hémoglobine.

L'appareil de von FceiscxL est d’un usage courant dans les oo allemandes. son emploi a fait l’objet de discussions Rue (68).

Mais, dans sa forme habituelle, il ne se prête qu’aux recherches de clinique.

Hémomètre de Fleischl-Miescher. — Miescer (69) a fait subir à l’appareil de von FLeiscuz certaines modifications qui, en lui gardant sa simplicité, l’ont notablement amélioré et ont fait de lui un instrument de tout premier choix pour les recherches de

physiologie.

La teneur en hémoglobine est donnée à 0,15 p. 100 près. Pipette colorimétrique de G. Hoppe-Seyler (70). — L’instrument de G. HoPpE-SEYLER

est également approprié aux recherches courantes de physiologie. Comme l'instrument de Miescxer, il donne la valeur absolue d’hémoglobine contenue dans un liquide. L’étalon est une solution d’hémoglobine oxycarbonée, pure, titrée, dont on prépare une fois pour toutes une solution. Celle-ci est conservée dans une série de petits flacons bien bouchés. Elle est inaltérable.

La dilution sanguine à observer doit être soumise à l’action d’un courant d’oxyde de carbone avant de pouvoir être comparée à l’étalon. Les résultats sont également très satisfaisants.

Elle peut aussi être appliquée aux recherches de la clinique.

Méthodes optiques basées sur l'absorption de la lumière par les solutions d’hémoglobine.— Méthode de Preyer. — Les solutions d'oxyhémoglobine suffisamment concentrées absorbent, comme on le sait, tous les rayons lumineux, à l’exception d’une partie des rayons rouges. Si l’on dilue progressivement une solution de cette concentration, il arrive un moment où quelques rayons verts s'ajoutent aux premiers. Cette apparition correspond à une concentration toujours la même. On détermine une fois pour toutes, au moyen d’un spectroscope déterminé, dont l'éclairage est constant, à quelle concentration correspond la première apparition du vert. Cette constatation faite, on pourra, à condition de faire toutes les observations avec une épaisseur de solution constante, ramener par dilution toutes les solutions d’oxyhémoglobine à ce même litre. C’est là le procédé de PREYER, procédé peu précis.

Ransewsky a proposé de remplacer la dilution par la variation d’épaisseur de la solution examinée dans des vases prismatiques à base rectangulaire. LAMBLING est arrivé au même but par un autre dispositif. Mais il rejette la méthode malgré ces perfectionnements.

Globulimètre de Mantegazza. — Le principe de cet instrument, qui n’est plus employé, est le suivant. Si l’on interpose entre la source lumineuse et la solution d’oxyhémoglobine des verres bleus, qui ne laissent passer que ceux des rayons lumineux qui sont le plus fortement absorbés par l’oxyhémoglobine, la lumière émise par la source est absorbée totalement par les deux substances colorantes. Pour arriver à cette extinction complète, il faudra employer d’autant plus de verres bleus que la solution d’oxyhémoglobine sera moins concentrée. D'où la possibilité de déterminer sa richesse en raison inverse du nombre des verres bleus employés.

Chromo-cytomètre de Bizzozero. — Une description complète de cet appareil se trouve donnée dans le travail de MaLassez cité précédemment (65). Il est destiné à mesurer l’opacité d’une dilution sanguine ou la concentration d’une solution d’oxyhémoglobine. L'appareil permet de diminuer ou d'augmenter à volonté l'épaisseur de la couche liquide examinée.

L'opacité recherchée est celle qui arrête les rayons lumineux du quart inférieur de la flamme d’une bougie à 1",5 de distance. Le pouvoir colorant est comparé, comme dans les appareils colorimétriques, à celui d’un étalon fixe.

Hématoscope de Hénocque. — Tout comme le cytomètre de B1zZ0ZER0, l'instrument de HéNocquE indique seulement l’opacité d’une dilution de sang dans un liquide isotonique, c’est-à-dire plutôt la richesse en globules que celle en hémoglobine, et ne permet par conséquent que des conclusions approximatives touchant ce dernier point.

Il se compose d’une lame de verre sur laquelle on place quelques gouttes du sang à examiner, On recouvre avec une deuxième lame reposant sur la première, de façon que l'épaisseur du liquide comprise entre les deux varie d’une extrémité à l’autre, l’espace limité entre elles affectant en coupe verticale la forme d’un triangle très allongé. La position étant donnée par des repères, l'appareil est placé sur une plaque d’émail portant des chiffres que l’on voit à travers la couche sanguine. Plus la couche est épaisse et colorée, moins la vision est distincte.

Une partie plus ou moins étendue des chiffres est masquée par le liquide coloré. Le dernier chiffre lisible indique la teneur pour 100 en hémoglobine.

Spectrophotométrie. — La spectrophotométrie, en tant que méthode générale de dosage des substances colorantes, est due à ViERORDT.

La détermination des constantes photométriques de l’hémoglobine et de ses dérivés fut l’objet de longues recherches de Hürner et de ses élèves.

De l'avis des nombreux auteurs qui ont essayé cette méthode, les résultats qu’elle fournit dépassent en exactitude ceux obtenus par toutes les autres. LAMBLING a cependant fait observer que les coefficients varient avec les différents appareils, d’où la nécessité de faire la détermination pour chaque espèce d'appareils.

La description des appareils et les détails de la méthode trouveront mieux leur place à l’article spécial : Spectrophotométrie.

Nous rappellerons ici que le principe de la méthode est le suivant :

Le rapport entre la concentration c d’une solution de matière colorante et le coeffi-

cient d’extinclion « de cette matière est constant. On l'appelle rapport d'absorption, et on le désigne par la lettre A.

Le coefficient d'extinction est donné par une lecture au spectrophotomètre. Le rap part d'absorption est établi une fois pour toutes. Ces deux valeurs étant connues, une simple multiplication permet de déterminer la concentration.

Ce = À &

HüenEr a déterminé à différentes reprises la valeur du rapport d'absorption de l'oxyhémoglobine en deux endroits du spectre d'absorption de cette substance.

D’après les dernières données de cet auteur, la valeur À — 0,002070 correspond à l'espace compris entre les deux bandes d'absorption (554 pu — 565 au), la valeur A' = 0,001312 correspond à la région de la deuxième bande (531,5 pu — 542,5 pu).

Non seulement la méthode de Vierorpr s'applique aux solutions contenant une seule substance colorante, mais elle possède encore l’inestimable avantage de permettre de doser simullanément plusieurs substances colorantes contenues dans un même liquide, à condition de connaître leurs constantes spectrophotométriques.

Vierorpr établit que l’absorption de lumière s’observant dans une partie déterminée du spectre d’une telle solution est égale à la somme des coefficients d’extinction en cette région des différentes substances prises isolément.

Il suffira donc de connaître les rapports d'absorption de chacune des substances colorantes en un endroit donné du spectre et de connaître ce rapport pour autant de régions qu’il y a de substances en solution, pour établir un système d’équations qui donnera la concentration de chaque substance.

En physiologie, on aura rarement l’occasion de doser ainsi à côté l’une de l’autre plusieurs substances colorantes. Mais le dosage de deux substances, telles que l’hémoglobine réduite et l’oxyhémoglobine existant côte à côte dans le même liquide et pouvant se transformer l’une dans l’autre, sera souvent très intéressant à faire. Un simple examen spectrophotométrique y conduit sans la moindre difficulté.

Si E est le coefficient d’extinction observé en un endroit donné du spectre, si A, est le rapport d'absorption pour l’oxyhémoglobine en cet endroit, et A, celui de l’hémoglobine réduite, on aura, d’après la loi de Vieroror, en faisant la concentration de l’oxyhémoglobine égale à x et celle de l’hémoglobine réduite à y :

D'où :

SRAT A UENAREETR AN DCI

, — AÿAN(EA,—E"A") LA AREA UE

En 1900, Hürner (71) a proposé une formule plus simple permettant la même / recherche. Si l’on suppose déterminé pour l’oxyhémoglobine le rapport = —1,578,

LA et pour l’hémoglobine réduite 2 — 0,762 correspondant aux régions déjà mentionnées

: G 2 du spectre, il est clair que la valeur — trouvée pour toute solution contenant un € mélange d'hémoglobine oxygénée et réduite doit être comprise entre ces deux limites. "1 Cette valeur + s’approchera d'autant plus de la limite supérieure 1,578 que la solution

sera plus oxygénée; elle tendra de plus en plus vers 0,762 dans le cas inverse.

HÉMOCGLOBINE. 349

D’après la loi de Vieronor, le coefficient d’extinction du mélange en un endroit du spectre est égal à la somme des coefficients d'extinction appartenant à la fraction réduite et à la fraction oxygénée.

Si l’on représente par x la quantité d’hémoglobine réduite rapportée à 100 parties du mélange on peut écrire :

e —(100 — x) €, + et (1)

De même

e — (100 — x) € + ax (2)

D'où

D’après les formules :

AMEN ARE (4) Moser APE (5) 9 = 1,529 (6)

dans lesquelles on connaît les valeurs de A,, AÀ,, A’, on peut calculer les différentes valeurs de &/,, :,, «, en fonction de «..

Si donc on fait £, — 1 pour l’unité de poids d’hémoglobine oxygénée dissous dans un volume donné d’eau, &', devient 1,578, &, — 1,529, :’,— 1,164, et l’on possède toutes les données nécessaires pour la résolution de l’équation (3) qui devient :

ao | m

. PRE 5 à Formule très simple, comme on le voit, dans laquelle la valeur — est donnée par ' €

l’observation spectrophotométrique.

HürNER à d’ailleurs joint à son mémoire une table donnant la valeur de x calculée

€ : ee d’après cette formule pour toutes les varialions de — comprises entre les deux limites

et distantes de plus de 0,005.

Hüener fournit une formule et une table de mème type pour les mélanges d’oxy- et de méthémoglobine et pour ceux d’hémoglobine oxygénée et carbonée.

Récemment, AroN et FR. MëLLer (195) ont constaté à l’examen du sang frais que le i4

€ : À rapport — n’est pas constant. Il varie notablement d’un animal à l’autre de même £o

espèce et même à différents moments chez le même animal. La valeur moyenne est sensiblement inférieure à celle donnée par HürNER. ARON attribue, dans un mémoire ultérieur sur cette question (195), cette irrégularité à l’existence dans le sang circulant

d’une quantité variable de mélhémoglobine. Il suffit de soumettre les échantillons aber- !

6 à rants à une réduction totale, suivie de réoxydation, pour trouver un rapport — satis- €o

faisant.