HÉMOLYSE PAR LES ALCALIS DILUÉS

On sait depuis Hewsox que les acides et les bases mêmes diluées provoquent l’hémolyse. Dans les solutions alcalines et acides très faibles, l’hémolyse est précédée d’une transformation des disques en sphères. Dans les alcalis, les hématies se rétrécissent avant l’hémolyse., L'étude de l’hémolyse par les alcalis a acquis beaucoup d'importance depuis qu’Arruenius et Mapsen en ont fait l’objet de recherches approfondies. Ces recherches ont inauguré l'application systématique au problème de l’hémolyse et à d’autres problèmes voisins, notamment celui des rapports des toxines et antitoxines, des méthodes de la physico-chimie moderne. Il est donc nécessaire de s’y arrêter.

La chimie habituelle s’occupe de l’étude des qualités chimiques de chaque substance, c’est-à-dire qu’elle est la longue énumération des aptitudes à réagir. La physico-chimie, qui s'appellerait tout aussi bien chimie générale, essaie de dégager de l’infinité des réactions les lois générales qui les commandent. Une réaction se caractérise surtout par les réactifs qui y prennent part, mais elle est aussi une mutation d'énergie. La définir par les réactifs employés, c’est faire de la chimie habituelle; la considérer plutôt dans ses rapports avec l’énergie qui s’absorbe ou se dégage, c’est faire de la physico-chimie. Cette partie de la science aura donc surtout à s'occuper de l'influence qu’exercent la pression, la température, l'électricité, bref les différentes modalités de l'énergie, sur la réaction chimique, sur la vitesse avec laquelle elle se poursuit, sur le nouvel état d'équilibre vers lequel elle tend.

Quand une réaction se passe en milieu homogène, il est surtout intéressant d'étudier l'influence de la concentration moléculaire des réactifs et celle de la température. Ces influences s’exercent, comme il a été dit, sur l’équilibre final et sur la vitesse avec laquelle le système tend vers cet équilibre.

Dans un grand nombre des cas qui se présentent à l'observation, la réaction est complète, c'est-à-dire qu’elle se poursuit jusqu’à disparition presque complète des

HÉMOLYSE. 193 réactifs qui figurent à gauche du signe de l’égalité. L'équilibre coïncide donc avec la disparition du premier membre de l'égalité. Dans ces conditions, il ne reste plus à étudier que la vitesse de la réaction.

Cette vitesse dépend alors, comme il a été dit, des concentrations moléculaires des différents-réactifs et de la température. Si l'on maintient la température constante, seul le premier facteur intervient.

Dans le cas le plus simple, où la concentration d’une seule substance se modifie au cours de la réaction, par exemple la destruction de l’arsénamine par la chaleur, on dira donc que la vitesse de la réaction est proportionnelle à la concentration de l’arsénamine, . ce qui s'exprime par l'équation différentielle

# — k(a — x) dans laquelle Æ est une constante, la constante de réaction; a, la concentration initiale de l’arsénamine ; &, la quantité transformée après un temps t.

En intégrant, on trouve

2e In(a — x) — kt + constante

et pour les conditions initiales, pour { —0 et x — 0,

— In a = constante, d’où, par soustraction

| Fe in a É ET

Cette équation s'applique donc aux réactions dans lesquelles une seule espèce chimique disparaît, les réactions monomoléculaires.

Quand, au cours d’une réaction, la concentration de deux réactifs va diminuant proportionnellement au poids d’une molécule de chacun d’eux, la réaction sera bimoléculaire. En représentant par a la concentration initiale de la première, par b la concentralion de la seconde et par x la quantité Du de a et de b (a et b disparaissent de façon équivalente), on aura

dx : ù a =ha—x) (b — x) ou dx A { \ a —6 (=) =,

soit, en intégrant,

TARA à [ln(b — x) — In(a — x)] — kl + constante,

et pour les conditions initiales, pour { —0 etxæ— 0,

Re (in b — In a) — constante, ?

d’où, par soustraction 1 (a — x)b

Si, au début de la réaction, les substances sont présentes en concentration équiva lente, on peut faire b — a, et les formules se simplifient :

dx cg

TE = k (a-x?

et, en intégrant,

AS NE Ne PO ES DA TM D OS DRE OU LT EUR

HÉMOLYSE.

Si trois espèces de molécules disparaissent pendant la réaction, réaction trimolécuaire, et si les concentrations initiales sont équivalentes, on aura

ne k (a-x}° ou 1 x (2a-x) TA 9e (a-x)?

} Un cas particulier de la réaction bimoléculaire est celui où l’une des deux substances est en large excès, de sorte que sa concentration peut êlre considérée comme constante

au cours de la réaction. Dans ces conditions, l’équa'ion

Là

dx PTE k(a-x) (b-x) doit être remplacée par dx TH = kb (a-x)

c’est-à-dire que la réaction devient monomoléculaire, avec une constante de réaction proportionnelle à la concentration de b.

Suivant donc qu’une, deux ou trois molécules disparaissent pendant la réaclion, la <onstante de Son prend trois formes très différentes :

{ «& { æ 2 Po €. (a-&) @ s Lx (2a-x) È #) RE T Da ane

Cette particulaité étant connue, elle fournit un fuir de se rendre compte de. fé facon dont un phénomène chimique se passe. C'est van’r Horr qui, le premier (Études de dynamique chimique, 188%), l’utilisa à cet effet. IL l’appliqua à l'étude de la décomposition de l’arsénamine et de la phosphamine par la chaleur. On aurait été tenté d’exprimer le phénomène par la formule

2 AsE3 — As2 + 3H

<e qui en faisait une réaction bimoléculaire.

Or, ayant calculé dans cette hypothèse la valeur de k au moyen des données expérimentales, il trouva une inconstance complète de £. Au contraire, dans l’hypothèse de la réaction monomoléculaire, k devenait remarquablement constant. D’où la conclusion que le phénomène est réellement monomoléculaire, ce qui veut dire que chaque molé- &ule d’arsénamine se décompose pour son propre compte en ses constituants, sans eatrer en relations avec ses voisines.

On voit que, si la physico-chimie à pour but habituel de dégager, de la multitude des faits, les lois générales, elle permet à l’occasion, par un Juste retour, d’entrer dans le détail d’un phénomène particulier, en indiquant, de facon précise, lequel de plusieurs mécanismes possibles est réellement en jeu.

I] peut arriver qu'on mesure difficilement un phénomène. Il est alors impossible de déterminer à n'importe quel moment de l’expérience où en est la réaction, quelle est, par exemple, la fraction déjà consommée d’une substance qui se transforme sous l’influence d’un catalyseur. Dans ces conditions, la détermination de la valeur de 4 devenant impossible, on peut essayer d'un moyen indirect pour s’éclairer sur la nature du phénomène. S'il est monomoléculaire et s’il se produit sous l'influence d’un agent catalytique, on détermine en combien de temps, des concentrations différentes de cet agent. produisent un même degré de transformation (début de coagulation, de florulation, éclaircissement d’un milieu opaque, etc.). À ce moment, on peut admettre qu’une

HEMOLYSE. 495

fraction æ, toujours la même, à été transformée. Or on à, sous l'influence d'une concentration q de l'agent catalytique,

— n (ax) = kqt + constante, — În a = constante

æt sous l’influence d’une concentration q’

— Un (a-x) = k q'l' + constante, — În a — constante

d’où

(4 in (=) AT FE Qt c’est-à-dire qu'un même degré de transformation de la substance envisagée, par des concentrations variables de Fagent catalytique se fait en des temps inversement proportionnels aux concentrations de l’agent catalytique, le produit du temps par la concentration étant constant.

Mais avant d'appliquer les formules précitées, il convient de dire quelques mots de l'influence de l’autre variable, la température. Toute élévation de température a pour effet d'accélérer notablement la vitesse du phénomène. Une différence de 10° suffit pour que la valeur de X devienne habituellement deux à trois fois plus considérable. Cet accroissement très rapide est caractéristique des phénomènes chimiques. Quand la température agit sur les phénomènes physiques (dissolution, diffusion, etc.), l'accélération qu'elle leur imprime est beaucoup moins considérable.

Elle fournit donc un moyen de savoir si un phénomène donné est de nature chimique.

ARRHENIUS exprime ces rapports par la formule suivante

de Er | ki = 0e 2 \Ti To

dans laquelle e est la base des logarithmes népériens, ki et ko représentent les constantes de réaction aux températures T, et T, comptées à partir du 0 absolu et y une constante -qui varie d'habitude entre 10 000 et 25 000.

Ces notions étant établies, on peut, quaud on se trouve en présence d’un phénomène dont on ignore la nature exacte, rechercher, à l'exemple de var Horr, s’il se conforme

aux relations précédentes et tirer, de cette confrontation, des résultats expérimentaux

avec les diverses possibilités théoriques, des ‘conclusions parfois tout à fait décisives sur la nature exacte du phénomène observé.

Seulement on observera que le raisonnement que l’on fait est un raisonnement par analogie. IL est nécessaire d’être très prudent quand on l’applique, car les analogies peuvent être accidentelles et toutes de surface. La force de conviction sera d'autant plus grande que les concordances entre l'observation et les exigences théoriques seront plus étendues et plus rigoureuses. Examinons ce qui en est des résultats expérimen- +aux d'ARRHENIUS et MApseN sur l’hémolyse par les liquides alcalins. La technique fut la suivante : les globules de cheval bien lavés étaient mis en suspension dans une solution salée (0.85 p. 100 NaCI) ou sucrée (7.79 p. 100 de saccharose). On leur ajoutait le réactif, on mettait, pendant un temps connu, à une température déterminée. Puis on faissait la sédimentation s'effectuer lentement dans une glacière (7°). Dans les expériences où l'influence du temps était plus spécialement étudiée, le refroidissement se faisait brusquement à 0° et était suivi de centrifugation; dans toutes les expériences, l’hémolyse fut mesurée par la quantité d’hémoglobine diffusée hors des globules. Cette fraction était exprimée en centièmes de la quantité totale de l’hémoglobine contenue dans es globules.

ARRHENIUS et MapsEN constatèrent d’abord que les globules peuvent fixer, par combipaison, une très petite quantité d’alcali, sans s’hémolyser. Cette fixation se fait très rapidement; la quantité fixée est proportionnelle à la richesse globulaire de l'émulsion. Pour produire l’hémolyse, il faut donc ajouter un excédent, et, puisque c’est cet excé- Æent qui cause l’hémolyse, on le considère seul comme quantité réellement active dans

da discussion des résultats.

* Ayant établi la quantité d’alcali nécessaire pour produire l'hémolyse totale, on peut

PE PAP TRE ES PE MN RU TT RAT AR Ed

4926 HÉMOLYSE.

en ajouter, à une émulsion d’hématies, une dose largement suffisante, de façon qu'ii y ait excès d’alcali pendant toute la durée de l'observation. On peut interrompre l’hémolyse d’un milieu ainsi préparé à différents moments, déterminer, à chacun de ces moments, la valeur de 100-x, 100 étant la teneur totale en hémoglobine, æ étant la quantité d'hémoglobine diffusée, et en déduire la valeur de la constante de réaction, en se plaçant dans l'hypothèse d’une réaction monomoléculaire :

Voici les résultats de deux expériences de ce genre faites avec une solution diluée d'ammoniaque :

On avait établi que la quantité d’alcali fixée par 10 cc. d’ émulsion globulaire était de 0.04 cc. d’une solution 1/10 Norm. de soude ou d’ammoniaque. Des tubes contenaient dans les expériences suivantes, faites à 37°, 10 cc. d'émulsion et

À 0°°.75 1/30 Norm. NH:

(A 13 21 51 82 minutes 100-x O1 89 620}, PTE k: 0.0010 0.0019 0.0047 0.0073 B 0°c.5 1/10 Norm. NH; l 6 14 23 31 minutes 100-x 97 82 60 °} 4 Lo k: 0.0022 0.0062 0.0096 0.0147 C 1 cc. 1/10 Norm. NH;:

l 5 9 15 19 minutes 100-x 91:58 80 D 'S 44° ki 0.0077 0.6107 0.0163 0.0187 D 2 cc. 1/10 Norm. NH3 l 2,25 6.2 8 min. 2 100-x 88 70 29 2/6 ki 0.026 0.025 0.028

S'il n'existe aucune constance du coefficient de réaction, cela ne prouve cependant pas que la réaction n’est pas monomoléculaire. Ce résultat doit être attribué, disent ARRHE- NIUS et MADsEN, à des causes secondaires, à l’existence d’un temps d'incubation qui correspond, entre autres possibilités, à la destruction des parois cellulaires par le réactif.

Dans ces conditions, il était indiqué de recourir à la méthode indirecte, qui consiste à rechercher si un même degré d’hémolyse est produit par des concentrations diverses de l’agent hémolytique en des temps inversement proportionnels aux concentrations.

Le tableau suivant (dont les valeurs dérivent par interpolation de celles du tableau précédent, en tenant compte de l’alcali combiné) indique les temps nécessaires à diverses dilutions (valeurs inverses des concentrations d’ammoniaque) pour produire divers degrés d’hémolyse. |

DEGRÉ. DE L'HÉMOLYSE. 3 10 °/o 20 ‘Jo 30 °/, 40 °/o

Temps,en minutes, mis par la solu-

tion d’ammoniaque dont la dilution

(1/q) est 1 44 (44) | 53 (53) 0.44 ; : > (15. 18 (19.4) | 23 (23.3) 0.23 .5 (6.0) j 12 (10.1) | 14 (12.2) 0.133 .8 (3.5 ke, 6.2 (5.9) 8 (1.1)

Entre parenthèses se trouvent les temps calculés, d’après les données de la première

HÉMOLYSE. 497

série horizontale, dans l'hypothèse d’une proportion entre la vitesse d’hémolyse et la concentration d’ammoniaque.

Ici l’accord entre les exigences de la réaction monomoléculaire et les données expérimentales est plus satisfaisant. AnrHENIUS et Mansen ont établi de plus qu elques relations numériques qui peuvent être utiles dans le calcul des données expérimentales. Elles ont trait à la valeur du degré d’hémolyse (fraction de l'hémoglob ine mise en liberté) en fonction du temps et de la concentration de l'hémolysine.

Les résultats diffèrent suivant la durée de l'expérience.

* Dans les expériences de courte durée, on trouve que le degré d’hémolyse est sensiblement proportionnel au carré de la concentration en alcali.

Voici un tableau dont les résultats se rapportent à des mélanges comprenant 10 cc. d'émulsion à 1 p. 100 et des quantités variables d’une solution 0.02 normale d’ammoniaque.

Dans la rangée horizontale a se trouvent indiquées les doses d’ammoniaque exprimées en fractions décimales de l’unité, qui est 4 cc. de la solution 0.02 normale. Dans la rangée b sont indiquées les quantités d'hémoglobine diffusée.

Les tubes sont laissés une heure à 37.

b 65 55 38 97 16 12 6 5 Vé 9.6 ul 12.3 12.8 11 ul 9.2 10.2

Au contraire, dans les expériences de longue durée, ce rapport se simplifie. On peu t constater alors une proportionnalité directe entre le degré d’hémolyse et la concentration d’alcali. Voici les résultats d’une expérience de vingt et une heures de durée à 37°, L'unité d’alcali et 1 cc. de solution à 0.025 N.

On peut enfin rechercher l'influence du temps. Tout le monde sait que, dans les hémolyses de moyenne intensité, il existe d'habitude un temps d’incubation, auquel fait suite l’hémolyse d’abord lente, qui s'accélère ensuite. Voici une expérience d’'ARRHENIUS et MADsEN qui établit des relations entre le degré d’hémolyse et la durée de l'expérience.

Les tubes contenaient 10 cc. d’une émulsion à 2.5 p. 100 de globules et 0.5 cc. d’une solution à 0.1 p. 100 de NH.

Temps (minutes). . . . 6 14 23 31

Degré d’hémolyse. . . . 3 18 40 65

NAT RTE APR 28 0 Nr AT MST IA NN 260

En rapprochant cette donnée de la première de celles qui expriment l'influence de la concentration de l’alcali, on arrive à la conclusion que le degré d'hémolyse est proportionnel au carré du produit du temps par la concentration dans certaines expériences de durée courte.

Maosen, Wazeu et Nocucui ont étudié l'influence de la température sur l’hémolyse par un grand nombre d’agents hémolytiques.

Pour ce qui concerne les alcalis, ils constatent que l'élévation de température détermine une accélération très notable de l’hémolyse, en confirmation de résultats antérieurs d’ArRHENIUS et MADsEN. Faisant le coefficient de réaction proportionnel à la concentration de l’alcali, ils introduisent cette valeur dans la formule

[22 (Ti Sn 41F) HE Lee DATES

et ils trouvent pour y une valeur de 26760 dans un essai de.courte durée. Il à été dit

428 HÉMOLYSE.

précédemment que, dans les réactions chimiques bien étudiées, les valeurs de y oscillent entre 10 000 et 25 000.

Si l’on compare entre elles l’action des différentes bases, on trouve que la quantité fixée par les globules (la dose non hémolysante) est exactement équivalente d’une base à l’autre. Les actions hémolysantes des bases fortes (KOH, NaOH, LiOH) sont égales. Celle des faibles concentrations d’ammoniaque est beaucoup moindre, si on la mesure après un temps court, l’hémolyse par l’ammoniaque étant plus lente. Si, au contraire, on fait la mesure après un temps suffisamment long (20 h.), l’'ammoniaque produit, à dose équivalente, une hémolyse égale à celle des bases fortes. Dans ces conditions, elle peut même dépasser les bases fortes, quand la concentration globulaire est élevée.

A équivalence de concentration, la valeur du coefficient 4 de la soude est deux'ou trois fois plus forte que celle de l’ammoniaque. Si l’action hydrolysante était uniquement due aux hydroxylions, l’écart devrait être beaucoup plus considérable, puisque, aux concentrations employées, la dissociation ionique de la soude est dix à vingt fois plus eonsidérable que celle de l’ammoniaque. ArRHeNIUS et Mapsex admettent, en conséquence, que l’action hémolytique est due à la coopération des molécules et des ions.

ARRHENIUS et MApsEN ont encore étudié l’influence que pouvaient exercer les sels neutres sur l’hémolyse causée par les alcalis correspondants. Ils ont constaté qu'à concentration (en équivalents) égale, le chlorure et le sulfate sodiques exercent sensiblement la même action inhibitrice sur l’hémolyse par l'hydrate sodique. Il en est de de même pour le sulfate et le chlorure ammoniques vis-vis de l’ammoniaque:

Seulement, tandis que les sels sodiques entravent peu, aux concentrations assez faibles employées, l’hémolyse par la soude, les sels ammoniques s'opposent énergiquement à l’hémolyse par l’ammoniaque.

Les deux tableaux suivants indiquent les résultats. Chaque tube contenait 10 cc. d’une émulsion de globules dans l’eau sucrée, plus une quantité indiquée d’une solution. La lettre Na désigne une solution 1/80 normale de NaOH, les lettres Na, 2C une solution de même concentration en soude que la précédente “et contenant, en plus, 0.02 gramme-équivalent par litre de NaCI; Na, 10C vaut 1/80 N de NaGH et 0.1 N de NaCI ; Na, 50C vaut 1/80 N de NaOH et 0.5 N de NaCl; Na, 10S vaut 1/80 N de NaOH et O1 N 4e Na, S0,; et Na, 50S vaut 1/80 N de NaOH, et 0.5 N de Na2S0..

QUANTITÉ | DE SOLUTION Na. : Na, ; Na, 50 C. Na, 10S, Na, 508$. ajoutée.

Les indications du deuxième tableau se rapportent à l’'ammoniaque et aux sels ammoniacaux (voir p. #29).

Après avoir exposé les résultats objectifs obtenus par ARRHENIUS et MADSEN, il nous reste à examiner les déductions qu’ils en ont tirées.

Pour eux, l'hémolyse par les alcalis est un processus chimique, comme en fait foi l'accroissement rapide de la constante de réaction que produit une hausse de la température. Ce processus chimique est monomoléculaire. À vrai dire, la constante de réaction, calculée dans cette hypothèse, est variable. Maïs, ainsi que cela a été dit plus haut, cela provient de circonstances accessoires : de ce que la réaction ne se déroule pas en milieu homogène, de l’action perturbante de la paroi globulaire qui s'oppose à la diffusion de l’hémoglobine, etc.

HÉMOLYSE. 129

QUANTITÉ DE SOLUTION NH3,. NH, 4 S. NH3, 10 S. NH:, 50 S. NHz, 10 C. NH3, 50 C. ajoutée.