DEUXIÈME PARTIE

Préparation de milieux de culture à base de lait

Le lait est un liquide organique dans lequel se trouvent rassemblés, en proportions convenables, tous les éléments nécessaires à la nutrition des microorganismes. On sait avec quelle facilité, avec quelle rapidité, s’y développent et y pullulent les germes d’agents pathogènes ou saprophytes venus de l'extérieur, lorsqu'il a été recueilli sans précaulions aseptiques. C’est un milieu de culture naturel, qui s’imposait au bactériologiste non seulement par son extrême fertilité, mais encore par sa composition qui est en relation assez étroite avec celle du sang ou des tissus de l’animal qui le fournit. C’est là un rapprochement qui porte naturellement à supposer que les microbes susceptibles de vivre et de se multiplier dans la substance d’un individu, doivent se mieux cultiver sur le lait que sur un milieu plus arbitrairement choisi.

Si cette ressemblance était la seule qualité qui dût recommander l’emploi du lait comme milieu de culture, il est bien évident qu'il faudrait le recueillir et le préparer sans altérer, ni Sa Composition, ni sa constitution : On ne devrait donc pas le stériliser par la Chaleur à cause des modifications qu’éprouverait la matière albuminoïde.

La stérilisation par filtration serait encore moins recommandable; il suffit en effet de se reporter aux expériences de M. Duclaux sur la matière albuminoïde du lait, pour voir combien la filtration sur une bougie peut modifier la constitution du lait.

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D'où la nécessité de le recueillir aseptiquement :

« I faut, dit M. Duclaux, pouvoir conserver ce liquide dans l'état même où il sort du pis de la vache. Il y a plusieurs procédés pour cela.

» Le plus simple de tous et le plus facile à mettre en œuvre partout, consiste à prendre des tubes préparés stériles.

» Pour y introduire du lait, on lave bien le pis de la vache, et quand les premiers mouvements de mulsion ont bien nettoyé les parois du canal, on enlève doucement avec une pince le bouchon de coton qui ferme le tube, et l’on dirige dans l'intérieur le liquide qui s'écoule, en ayant soin de tenir le tube tout près de la mamelle, sans pourtant la toucher. On ne peut éviter qu'une portion de lait ne coule à l'extérieur du tube ; cela est sans importance et il vaut mieux le perdre que chercher à le recueillir. On remet le bouchon qu’un aide à gardé à l’extrémité de la pince, et on reporte le tout au laboratoire.

» On doit préparer ainsi plusieurs tubes, quelques-uns s’altèrent, cela est inévitable avec une manipulation aussi délicate, mais il y en a toujours un grand nombre qui restent inaltérés, si on a bien opéré. »

Le milieu ainsi préparé présente de sérieux inconvénients qui en font restreindre l’emploi à quelques cas particuliers.

D'abord, à cause du beurre qu’il tient en suspension, il n’a pas la transparence qu’on exige généralement des milieux de culture.

D'autre part, étant donné un bouillon transparent, on veut que les réactions qu'y apportera le microbe ensemencé n’en altèrent la constitution que dans une certaine mesure : le milieu cultivé doit, après l’ensemencement, rester presque semblable au milieu initial stérile. Or, il n’en est pas ainsi dans le cas où ce bouillon de culture est le lait. Sous l’influence de la moindre fermentation acide, ce liquide se remplit de gros caïllots formés de caséine et de beurre ; le milieu dans lequel se sont produites de telles perturbations ne ressemble en rien au milieu primitif :

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celui-ci était liquide avant l’ensemencement, il est, après, devenu presque solide.

Mais, hâtons-nous de le dire, cette propriété de se cailler si facilement, que présente le lait, est, dans certains cas, recherchée, utilisée, pour caractériser un ferment figuré producteur d’acide : pour différencier le bacille d’Eberth du bacterium coli, par exemple.

En supprimant les inconvénients que nous venons de signaler, nous nous proposons ici de préparer avec le lait un milieu approprié à la culture de tous les microbes en général.

Il est bien évident que nous devrons, pour cela, toucher à la constitution du lait et que, par suite, nous lui enlèverons cette ressemblance avec les humeurs et les tissus dont nous parlions plus haut. Mais le milieu ainsi préparé n’en gardera pas moins la composition élémentaire du lait (moins les éléments correspondant à la graisse, éléments dont la présence n’est pas démontrée nécessaire à la nutrition des microorganismes), c’est-à-dire qu'il restera très fertile.

Nous croyons devoir, avant d’indiquer les procédés qui nous ont servi à préparer ce milieu général, dire comment on peut obtenir des milieux de culture transparents, à base de lait, ou, plus simplement, comment on peut enlever au lait tout son beurre de façon à n’avoir plus qu'une solution de caséine, de sucre et et de sels minéraux. Solution qui possède encore, comme le lait non préparé, la propriété de se coaguler par des traces d'acide.

MILIEUX DE CULTURE TRANSPARENTS OBTENUS EN PRIVANT LE LAIT DE SON BEURRE

Dans les procédés (autres que celui indiqué par M. Duclaux et signalé plus haut), habituellement employés pour préparer le lait — milieu de culture — on se préoccupe de lui enlever la

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plus grande partie de ses graisses. Pour cela, on le stérilise d’abord, puis, on l’abandonne au repos pendant un certain temps : les globules gras montent à la surface pour former une couche plus ou moins épaisse selon la température et le temps pendant lequel on a laissé reposer ; on décante la couche inférieure à l’aide de siphons ou de pipettes de Chamberland stériles. Le lait ainsi préparé n’est pas transparent puisqu'il contient encore beaucoup de beurre.

L'industrie laitière pratique aujourd’hui l’écrémage en grand ; il n’est pas difficile de se procurer de ce lait presque complètement dégraissé, mais non encore transparent et ne présentant guère d'avantages sur celui que fournit la précédente méthode : car, si la force centrifuge à l’action de laquelle ce lait a été soumis l'a plus complètement privé de graisses, elle lui a en outre enlevé une portion de ses autres constituants.

Ainsi, les procédés que nous venons de citer ne débarrassant pas complètement le lait de son beurre. Il n’en est pas de même du suivant, qui consiste dans une simple filtration sur papier filtre ordinaire.

Les chimistes qui se sont occupés de l’analyse immédiate du lait ont songé à le filtrer : Bouchardat et Quevenne employaient plusieurs doubles de papier et remettaient les premières portions sur le filtre jusqu’à obtention d’un liquile clair; M. Béchamp opère d’une façon analogue, mais à la température de 0°. Ces opérations sont fort longues, assez pour que des microorganismes puissent altérer le produit soumis à la filtration, surtout si l'on n’opère pas à basse température. Cette dernière condition n’a pas seulement pour but d'empêcher le développement des microbes, elle rend la filtration plus facile.

En modifiant quelque peu ces procédés, nous avons pu nous procurer très rapidement des quantités notables de lait filtré. Dans un espace de huit à dix heures, on a facilement un

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demi-litre de produit filtré absolument transparent ou légèrement opalescent, en opérant de la façon suivante :

Lait de vache. — On le stérilise à 145°, puis on l’'abandonne vingt-quatre heures an repos dans un lieu frais; après ce repos, on sépare la couche inférieure de la plus grande partie de la graisse qui est montée à la surface; cette décantation se fait très facilement au moyen d’un siphon et dans des conditions aseptiques qu’il est inutile de décrire, puisque chacun peut les pratiquer à sa manière; d’ailleurs, l’asepsie parfaite importe peu, puisque ce produit, partiellement écrémé, doit être filtré. Pour cela, on le jette sur un filtre ordinaire après l'avoir mélangé de 2 gr. pour 1000 de chloroforme.

Le filtre est placé dans un premier entonnoir dont la douille s'engage dans celle d’un second. Il résulté de cette disposition un espace annulaire, dans lequel on place la glace pilée destinée à maintenir la température au voisinage de 0.

Le chloroforme ajouté au lait empêche le développement des microorganismes : il sera chassé pendant la stérilisation qu’on fait ensuite subir au produit filtré.

Mais avant de stériliser, il est bon de rechercher quelle est la réaction du lait; dans le cas où elle serait acide, et elle ne peut l'être que très faiblement si on a opéré avec un lait frais non altéré, il faut la neutraliser et même Ia rendre très légèrement alcaline.

Il résulte de cette précaution qu’une très petite quantité de matière albuminoïde seulement se précipite pendant la stérilisation. Quelquefois même il ne s’en précipite point. On filtre le produit ainsi stérilisé avant de le mettre en tubes. Ceux-ci contiennent alors un liquide définitivement clair ; on les stérilise une dernière fois comme des tubes de bouillon ordinaire.

On peut avec ce lait sans beurre, ce bouillon, préparer des milieux solides gélatinisés ou gelosés à la façon ordinaire.

Le bouillon ainsi préparé contient tous les éléments du lait

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sauf le beurre; une certaine quantité de matière albuminoïde a pu rester sur le filtre : mais la plus grande partie de cette substance est restée en dissolution dans le produit filtré, ainsi qu’on peut s’en assurer par addition d’une trace d'acide.

Ce milieu reste, comme le lait ordinaire, propre à la recherche des microbes qui transforment le lactose en acide lactique :

Lorsqu'on l’ensemence de bacterium coli, par exemple, on voit très rapidement le °milieu primitivement transparent se remplir de gros flocons de caséine.

Lait de femme. — Nous avons à l’aide des mêmes procédés que nous venons de décrire, mais sans la stérilisation initiale,

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préparé des bouillons transparents et des milieux solides à base de lait de femme ; ce dernier lait est même beaucoup plus facile à préparer que le précédent.

Nous nous sommes. borné à constater que la plupart des microbes pathogènes cultivaient très bien sur ce milieu : nous

avons ensemencé :

Les streptocoques ; Les staphylocoques ; Le bacterium coli ; Le bacille de la diphtérie ; Le bacille pyocyanique ; Et le bacille de la tuberculose humaine,

Nous n'avons pas insisté sur les caractères que peuvent présenter ces cultures et nous tenons à faire cette remarque que, pour la tubereulose, la culture apparue très nette après trois semaines, provenait d'une culture sur gélose glycérinée et non des produits tuberculeux d’un cobaye injecté ; en un mot, c'était un repiquage.

Il serait intéressant peut-ètre d'étudier plus en détail ce milieu au point de vue de la culture d’espèces pathogènes. Nous n'avons pu le faire encore.

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MILIEUX DE CULTURE OBTENUS PAR PEPTONISATION DE LA MATIÈRE ALBUMINOÏDE DU LAIT

Nous venons de voir comment on pouvait, par filtration, priver le lait de ses graisses pour en faire un bouillon trans-

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parent : le milieu ainsi préparé contient encore de la caséine précipitable par les moindres traces d’acide. Nous allons maintenant décrire les procédés qui nous ont servi à modifier le lait de manière à en faire un milieu transparent et non coagulable par les acides.

Nous avons dit au commenceinent du chapitre précédent (page 11) comment pendant une digestion artificielle de lait, la matière albuminoïde d’abord précipitée rentrait peu à peu en dissolution sous forme de peptones : la graisse entraînée avec la caséine reste, dans le cas d’une digestion pepsique, non attaquée et mélangée aux résidus d’albuminoïdes non digérés (dyspeptones de Meissner)}. Nous avons aussi fait remarquer que la digestion pancréatique artificielle du lait pouvait en milieu neutre et en l’absence du lab-ferment s’opérer sans pré. Cipitation préalable de la matière albuminoïde.

Les produits de digestion artificielle ainsi obtenus, clarifiés et filtrés, sont des milieux de culture très fertiles.

Nous allons indiquer les procédés qui permettent de les obtenir commodément, soit par digestions pepsiques, soit par digestions pancréatiques; celles-ci, disons-le tout de suite, sont de beaucoup préférables aux autres, parce qu’elles s’opèrent plus rapidement, tout en fournissant un milieu plus nutritif.

I. — Digestions pepsiques. — On stérilise un litre de lait à l’autoclave à 115 ou 120° (Une température trop élevée et trop longtemps maintenue fournit des milieux colorés). On laisse ensuite refroidir ce lait à 37 ou 40, et on l’adidtionne à cette température de 30 centimètres cubes de la solution suivante :

Pepsine (lire 10) PRE RS RENE 7e & grammes.

Acide chlorhydrique (D = 1.21) . . 10 centimètres cubes. AUS Re RTE TAC 110

Cette solution se conserve très bien, car l'acide chlorhydrique qu'elle contient est antiseptique.

On maintient la digestion pendant 15 à 20 heures dans l'étuve de Roux à 37 ou 40e.

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Puis, on arrête la digestion par stérilisation à l’autoclave : on laisse refroidir. On décante le liquide légèrement trouble pour le séparer du précipité qui nuage à la surface ; on filtre sur un papier filtre ordinaire, après avoir neutralisé, par la

lessive de soude,

l'acide chlorhydrique ajouté au commence.

ment de la digestion. (On peut filtrer chaud sur un filtre Chardin mouillé après avoir clarifié à l’albumine le produit décanté).

Composition du bouillon provenant de digestions pepsiques. — Voici des analyses donnant la composition de quelques-uns de

ces bouillons :

N° 1 Azote 3 gr.

Sels minéraux 6 gr.

Extrait sec. 84 gr.

Lactose. 55 gr.

Digestion ayant duré

15 heures à 40°

Cette quantité d’azote correspond à environ 23 gr. de peptone;

les sels minéraux contiennent :

acide phosphorique, chaux,

potasse et magnésie, dans les mêmes proportions que les cendres

de lait de vache.

N°e NOIR ee Re en ete ES ed AD Sels minéraux. ; HT OT EXTRAITS SM ER CUT ER 63e N°3 Azote . 4 gr.

Sels minéraux 7 gr.

Lactose. 58 gr.

Extrait sec. 94 er.

Digestion ayant duré 30 heures

Digestion ayant duré 34 heures

La densité de ces bouillons est voisine de 1034: ils diffèrent des suivants surtout par la plus grande proportion de chlorure de sodium (formé par neutralisation de l'acide chlorhydrique).

IL. — Digestions pancréatiques. — Les digestions artificielles au moyen de la pepsine, même très active, sont fort longues ainsi