METHODES DE DOSAGE DE L'HEMOGLOBINE

L'hémoglobine est une substance capable

1° de fixer 100 fois plus d'oxygène qu'il ne peut en être dissous dans le plasma;

2° de donner aux tissus autant d'oxygène qu'ils en ont besoin pendant le passage dans les capillaires.

Elle $e trouve seulement dans les hématies.

Elle contient un chromogène caractérisé par le fer sous forme de sel ferreux, celui-ci peut fixer autant de molécules de gaz qu'il contient d’atomes de fer.

L'hémoglobine peut donner des combinaisons réversibles avec des gaz comme l'oxygène, l’oxyde de carbone.

On peut donc prévoir des possibilités de dosage de l’hémo-

globine :

— par la coloration directe ou indirecte du chromogèn — par le dosage du fer; — par le dosage du gaz combiné.

Quelle est la valeur normale de l’hémoglobine ?

C'est un point capital sur lequel les auteurs sont loin d’être d'accord. Chez l'homme normal, les documents existants donnent des chiffres différents.

Pour Fabre, la quantité d'hémoglobine est de 43 g. 5 . 400;

Fe Haldane, elle est de 13 g. 8 p. 100;

Pour Haden, elle est de 15 g 6 p. 100;

Pour Williamson, elle est de 16 g. 9 p. 100.

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Une entente serait désirable.

Néanmoins, il semble que le chiffre de Haden soit le plus près de la vérité.

Il existe également des variations en rapport avec certains facteurs.

1° Le sexe. — Il influe sur le taux d’hémoglobine, et Osgood, Wintrobe, Haden, donnent des chiffres différents pour l’homme et pour la femme :

Osgood : homme, 16; femme, 13,60; Wintrobe : homme, 17; femme, 13,70; Haden : homme, 15,34; femme, 13,37.

2° L'âge. — A un jour, le taux de l’hémoglobine est de 23 2. p. 100.

À un an, il est de 13 grammes.

A trois ans, il est de 12 grammes, il remonte ensuite jusqu'à 15 grammes, pour y rester jusqu'à 60 ans; à partir de ce moment, il commence à décroître,

3° Variations journalières. — Rabinovitch donne des taux allant de 97 p. 100 à 71 p. 100, soit donc une variation de 26 p. 100 chez un patient dans la même journée. Il faut tenir compte des repas, qui peuvent influencer dans une certaine mesure le taux de l’hémoglobine.

Mais le doute vient aussi de ce qu'il n’y ait pas un étalon international.

On trouve trois unités différentes dans la littérature. L'hémoglobine est exprimée

tantôt en grammes d'hémoglobine;

tantôt en capacité en oxygène;

tantôt en pourcentage par rapport à un étalon fixé arbitrairement.

Or, cet étalon est variable suivant la base. Le même sang normal, si on en prend pour 100, le chiffre de Haden, 15,6, sera 20 p. 100 trop faible pour le pourcentage pris par

Williamson, 20 p. 100 trop fort pour celui pris par Haldane,

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Il faut donc prendre comme unité le gramme d’hémoglobine.

Il peut être fourni :

1° Par la capacité en oxygène ou en oxyde de carbone en appliquant le facteur de Hüfner : 1 gramme d’hémoglobine saturé d’O ou de CO peut libérer 1 cm 34 de gaz;

2 Par le dosage du fer : 1 gramme d’hémoglobine correspond à 0,0034 g. de fer.

Historique et classification des méthodes.

En 1820, Le Cann, Prévost et Dumas ont dosé le fer du sang (Murphy, Lynch, Howard, Arch. int. med., 47, 885, 1931).

En 1878, Gowers utilise une méthode colorimétrique par dilution. simple du sang et prépare un étalon artificiel de gélatine colorée au picrocarmin.

À l'heure actuelle, on peut classer les méthodes de la manière suivante

méthodes spectrométriques; méthodes gazométriques; méthodes chimiques; méthodes colorimétriques.

1° Les méthodes spectrométriques.

Le dosage spectrométrique de l’hémoglobine dans le sang a l'avantage sur les procédés colorimétriques de porter sur du sang pur, non dilué, et d'éliminer dans une certaine mesure le coefficient personnel de vision des couleurs. Il est plus exact pour un observateur exercé, mais il demande un certain apprentissage; il a l’inconvénient d’exiger une quantité de sang un peu plus considérable. Il existe pour ce dosage plusieurs méthodes reposant sur deux principes différents :

Le premier, sur lequel sont basées les méthodes généralement employées, est que toute dissolution de sang dans

l’eau, qui exerce sur le spectre un pouvoir absorbant équivalent à celui d’une solution déterminée d'oxyhémoglobine, contient une quantité égale de cette substance. Ces méthodes ont le sérieux inconvénient de réclamer l’usage d’une solution fixe et connue d’oxyhémoglobine; or, cette substance a le désavantage de s’altérer très facilement, ce qui rend ces procédés difficilement utilisables.

Le seconde procédé a été préconisé par Henocque.

Le sang pur normal, lorsqu'il est sous une épaisseur de 10 x“, donne un spectre de l’oxyhémoglobine dans lequel les deux bandes caractéristiques de cette substance sont égales en largeur et en intensité.

Sous une épaisseur plus considérable ou plus petite, les deux bandes cessent d'être sensiblement égales, soit en largeur, soit en intensité. |

Ce qu'Hénocque appelle le phénomène des deux bandes égales coïnciderait donc sous une épaisseur de 70 & avec la présence d’une quantité fixe (15 p. 100) d’oxyhémoglobine dans le sang. Plus l’épaisseur de sang nécessaire pour obtenir le phénomène des deux bandes égales sera grande, moins le sang examiné sera riche en oxyhémoglobine. C'est la base du principe du dosage à l’aide de l’hématoscope de Hénocque, appareil fréquemment employé. Nous avons également à notre disposition le spectrophotomètre de Williamson, appareil modernisé où les lectures sont faites à l’aide d’une cellule photoélectrique dont la déviation de l’aiguille indique l'épaisseur de la bande d'absorption.

2° Les méthodes gazométriques.

a) Méthode de Van Slyke. — L'appareil permet de dégager et de mesurer gazométriquement tous les gaz du sang. On peut opérer sur CO ou O. Pour obtenir l’oxyde de carbone on traite le sang par l’acide sulfurique concentré, pour obtenir l'oxygène, on le traite par le ferricyanure de potassium. Le vide réalisé à l’aide de la pompe à mercure dégage complètement l’un et l’autre de ces gaz.

On emprisonne le sang dans une ampoule latérale et on fait la lecture. Lorsqu'on opère sur l’oxyde de carbone, on a l’avantage de n’'utiliser que 1 cm? de sang, tandis qu'avec l'oxygène il faut une quantité plus grande.

b) Méthode de Haldane. — Elle consiste à faire deux dosages successifs : l’un de l’oxygène absorbable par le sang, l’autre de l’oxygène dégagé.

Dans un premier temps, on hémolyse le sang par la saponine et on agite au contact de l’air. L’oxygène est absorbé. On remet le niveau de la burette au zéro de l’échelle.

Dans le second temps, on ajoute au mélange le ferricyanure de potassium; l'oxygène se dégage. La différence de niveau sur l’échelle donne le résultat.

c) Méthode de Nicloux. — On sature le sang par l’oxyde de carbone. L’hémoglobine donne de la carboxyhémoglobine. On traite le sang par l'acide phosphorique et on fait le vide dans l’appareil. L’oxyde de carbone se dégage; on fait arriver de l’eau dans l’ampoule, dans la partie supérieure on a de l’oxyde de carbone gazeux. On fait passer cet oxyde de carbone dans l’eudiomètre où se trouve de l’oxygène. L’oxyde de carbone se transforme alors en gaz carbonique. On le fait absorber par de la potasse, la différence de volume donne le volume de l’oxyde de carbone.

3° Les méthodes chimiques.

Elles sont nombreuses, et les différenciations qui existent entre elles viennent du mode de destruction de la matière organique. Elles procèdent soit par incinération, soit par destruction en milieu humide acide.

a) Les méthodes de Fleury et Marque, de Fontès et Thivolle consistent à incinérer la matière organique, les cendres sont dissoutes dans l’acide chlorhydrique concentré. La solution lerrique est réduite à l’état ferreux par le mercure et titrée au permanganate.

b) Méthode de Lapicque. — Le sang est également incinéré,

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mais On termine la destruction en s’aidant de l'acide sulfurique et de l’acide azotique.

c) Méthode de Denigès. — Elle repose sur la production d'une coloration jaune intense due à la formation d’un acide chloroferrique par l’action d'une solution chlorhydrique concentrée sur le fer trivalent. Cette coloration est proportionnelle au fer trivalent mis en expérience.

d) Méthode de Kennedy. — On fait agir l'acide sulfurique concentré en présence d'acide perchlorique., e) Méthode de Zizine. — On décompose le sang en chauf-

fant en présence d'acide sulfurique et de chlorate de potasse. Le résidu est repris par l’eau et alcalinisé par la soude.

On se débarrasse de l’ammoniaque formée en chauffant. On ajoute le réactif à l’alloxantine et on compare avec l’étalon.

î) Méthode de. Wong. — Nous nous réservons le soin de la décrire dans notre second chapitre.

4° Les méthodes colorimétriques.

a) COLORATION PROPRE DE L OXYHÉMOGLOBINE.

Méthode de Tallquist. — L'hémoglobinomètre de Tallqvist est composé d'une échelle de 10 rectangles, percés au centre d’un orifice arrondi, colorés en rouge de plus en plus intense et numérotés 10, 20, 30, …, 100; la teinte du rectangle 100 correspond à celle du sang normal, dont la teneur en hémoslobine est précise comme terme de comparaison.

La goutte de sang produite par piqûre de la phalangette ou du lobule de l'oreille est recueillie sur une bandelette de papier buvard blanc spécial livré avec l'échelle. Dès que la tache a perdu son aspect brillant, on la glisse sous l’échelle colorée en la comparant par les orifices aux différentes tein- tes; si par exemple elle a la même teinte que le rectangle marqué 60, nous dirons que le sang examiné renferme 60 p. 106 de l’hémoglobine du sang normal.

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Méthodes de Gowers, Hayem, Malassez. — Elles reposent sur la dilution du sang. On aspire celui-ci à l’aide d’une pipette et on le dilue soit avec de l’eau ordinaire (Gowers), soit avec de l’eau distillée (Malassez et Hayem). On compare ensuite l'intensité colorante de la dilution à celle d’un étalon approprié. Cette comparaison doit toujours être faite dans les mêmes conditions de lumière. Les résultats sont exprimés suivant les appareils employés selon trois types d’échelles colorimétriques.,

Type I (appareil de Hayem) : L’échelle est basée sur la couleur communiquée à 500 num d’eau distillée par un nombre déterminé de globules rouges. Elle a été établie par comparaison avec des dilutions de sang normal dont on connaissait le nombre de globules rouges par millimètre cube. La richesse en hémoglobine est donc exprimée en nombre de globules rouges sains.

Type Il (appareil de Gowers) : Dans cette échelle, une solution fixe et connue de sang normal est prise comme point de repère supérieur. Elle donne 100 p. 100. L'eau pure donne 0 p. 100. L’échelle est établie entre ces deux points. Elle indique donc en pourcentage le rapport de la richesse en hémoglobine du sang examiné avec la richesse du sang normal. Un sang ayant 50 p. 100 d’hémoglobine est un sang ayant deux fois moins d'hémoglobine qu'un sang normal.

Type HI (appareil Malassez) : Cette échelle est basée sur la richesse du sang en poids absolu d’hémoglobine. On estime que celle-ci est à l’état normal de 14 à 15 p. 100 chez l’homme. Les chiffres sont établis par comparaison avec des dilutions d'hémoglobine de moins en moins fortes. Il en résulte qu’un sang ayant 7,5 p. 100 d'hémoglobine avec l’échelle du type II sera l'équivalent d’un sang ayant 50 p. 100 d’hémoglobine avec l'échelle du type IL.

Citons également la méthode de Hallion et Borrien, dont l'appareil se compose d’étalons stables allant de 10 p. 100 à 100 p. 100 d'hémoglobine entre lesquels on glisse le tube de la solution à doser.

LANCE RER b) MÉTHODE À LA CARBOXYHÉMOGLOBINE.

C'est la méthode de Palmer. — L'échantillon de sang est mélangé à une solution ammoniacale. On fait passer dans ce mélange le gaz d'éclairage. Il se forme de la carboxyhémoglobine. On n’a plus qu'à comparer la couleur de la solution et celle de l’étalon dans un colorimètre.

€) MÉTHODE À L'HÉMATINE ACIDE.

Méthode de Sahli. — Salhi a voulu éviter l'instabilité et la couleur trop jaune des étalons au picrocarmin. Dans ce but, il transforme l’hémoglobine en chlorhydrate d'hématine, qui à une couleur brun foncé. Pour cela, il mélange le sang à une solution d'acide chlorhydrique. On ajoute ensuite de l’eau pour arriver à égalité de teinte avec l’étalon.

Méthode de Newcomer. — Cette méthode a l’avantage d’utiliser comme étalon une série de plaques de verre, dont la couleur restera toujours la même. Ces verres étalons sont faits d'une seule pièce et possèdent un pouvoir d'absorption égal à celui de l’hématine acide. Le colorimètre se compose de deux tubes. Dans l’un on place de l’eau et au-devant le verre étalon. Dans l’autre, on met une solution d'acide chlorhydrique à laquelle on ajoute l'échantillon de sang.

La partie inférieure de la colonne de verre est amenée au contact de l’eau du côté de l’étalon. Les couleurs sont égalisées en plongeant le tube de verre dans la solution de sang.

d) MÉTHODE À L'HÉMATINE ALCALINE.

Méthode de Cohen et Smith à l'hématine acide modifiée par Wu en hématine alcaline. — La quantité de sang nécessaire est mélangée à une solution d'acide chlorhydrique au 10°. On place le tube dans l’eau à 35 ou 40 degrés pendant dix minutes, puis on laisse quarante minutes à la température de la pièce. On ajoute au mélange 5 cm3 de la solution d'hydroxyde de sodium à 106 p. 100. On compare dans un colori-

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mètre le mélange ainsi préparé avec la solution étalon, à laquelle a été ajoutée au même moment le même volume de la solution d'hydroxyde à 10 p. 100.

e) MÉTHODE A LA CYANHÉMOGLOBINE.

Méthode de Stadie-Wu. — On dilue le sang avec une solution ammoniacale à 4 p. 160. On ajoute du ferricyanure pour changer l’hémoglobine en méthémoglobine. Après vingt minutes, on additionne au mélange une solution de cyanure de potassium qui va former la cyanhémoglobine. On n'aura plus qu'à comparer la couleur de la solution avec celle de l’étalon.

Choix d’une méthode.

Nous nous plaçons avant tout au point de vue clinique. Aussi ne peut-il être question que de méthodes simples donnant des lectures rapides. Les méthodes colorimétriques sont par excellence celles qui répondent à ces conditions; elles ont, en outre, l'avantage de ne demander qu'une petite quantité de sang. Malgré cela, elles ont soulevé de nombreuses critiques, car elles ne donnent pas toujours des résultats fidèles. Les méthodes de coloration de l’oxyhémoglobine (méthodes de Tallquist, de Hayem, de Gowers, de Malassez, de Hallion et Borrien) sont certainement les plus simples, mais elles donnent souvent des erreurs grossières dues à la mauvaise conservation et à l’altération du liquide de Ja solution étalon.

Les méthodes à la carboxyhémoglobine ont l'inconvénient d'utiliser un gaz toxique, c'est là une raison pour les éliminer.

Les méthodes à l’hématine acide sont les plus utilisées, mais elles ne sont pas sans avoir été chaudement critiquées. Nous avons vu que Fontès et Thivolle ont apporté la preuve de l'insuffisance de la méthode de Salhi à la Société d’hématologie. Quoi qu'il en soit, elles ont de nombreux parti-

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sans. Terrill d’abord, Sahli ensuite, qui les ont introduites, les considèrent comme de bonnes méthodes, qui doivent être retenues à cause de leur simplicité. Newcomer était également un de leurs défenseurs. D’autres auteurs : Cohen et Smith, Robscheit et Sevety, trouvèrent des résultats acceptables à condition que les étalons aient été préparés en même temps.

Berczeller prouva que la couleur obtenue dépendait en partie du plasma. Une suspension donnée de globules rouges de mouton, mélangée à un plasma de mouton différent, donnent des couleurs variant de 10 p. 106 et plus. Wu trouva aussi que la couleur du sang dilué avec l'acide était troublée par les substances non hémoglobiniques contenues à la fois dans le plasma et dans le stroma des globules rouges. Pour cet auteur, l'hémoglobine puriiée dissoute dans le plasma . donne une lecture 20 p. 100 plus forte que lorsqu'elle est dis soute dans une solution salée, et les globules rouges, qui avaient été simplement lavés, donnent une lecture plus petite en suspension dans le plasma qu'en suspension dans une solution salée. Ces effets particuliers disparaîtraient quand les solutions de sang seraïent alcalinisées avant que les lectures soient faites. Wu attribua les anomalies des solutions acides au fait que dans celles-ci les dérivés de l'hémoglobine formaient une suspension colloïdale plutôt qu'une véritable solution, et la nuance ainsi que l'intensité de la couleur étaient influencées par des facteurs altérant l’état de la dispersion. Nous avons tenu à vérifier les objections de cet auteur lorsqu'il dit qu’une cause d'erreur réside dans l’altération des couleurs du sang par des substances non hémoglobiniques contenues dans le plasma. À plusieurs reprises, nous avons centrilugé le sang provenant d’un anémique que nous avions préalablement fluoré et nous avons remplacé le plasma par une quantité égale de plasma d’un individu normal. Les lectures faites dans les deux cas donnèrent des résultats identiques.

Wu trouva que les meilleures lectures étaient obtenues