XXVII

A, pipette pour le sérum B, pipette pour le sang.

reurs causées par l'aberration de sphéricité, porte des divisions qui permettent de recueillir à volonté 2; 2,5; 3; 4; 5 millimètres cubes de sang.

L'extrémité par laquelle on aspire le sang est taillée en pointe, l'autre extrémité au niveau de laquelle le tube capillaire doit présenter une petite chambre à air est cylindrique et s'adapte à un tube de caoutchouc. La seconde pipette (A) qu'il est inutile de décrire est calibrée de manière à permettre de prendre 500 millimètres cubes de sérum. Les deux liquides, sérum et sang, sont déposés dans une petite éprouvette et mélangés intimement à l'aide d'un petit agitateur à palette (fig. 7).

Mais quel liquide employer pour diluer le sang? C'est là une question extrêmement importante à laquelle on ne saurait accorder une trop grande attention. Il n'existe, en effet, qu'un très petit nombre de sérums artificiels, conservant, sans en détruire aucun, les éléments du sang et, malgré mes avertissements réitérés, la plupart des médecins et des physiologistes qui ont fait dans ces dernières années des travaux sur le dénombrement des éléments du sang se sont servis de liquides qui en font disparaître une certaine proportion.

Pendant quelque temps, j'ai utilisé le sérum iodé de Max Schultze (p. 14); mais comme ce liquide est assez difficile à préparer et qu'il exerce souvent sur les hématies du sang des animaux une action destructive notable, j'ai dû imaginer d'autres véhicules.

Après bien des essais, je me suis arrêté à l'usage du liquide A, dont j'ai donné plus haut la formule (p. 16). Ce liquide s'applique parfaitement à la numération des globules rouges et des globules blancs chez l'homme et chez les animaux, car il n'en détruit jamais un seul, même dans les cas d'anémie extrême. Mais il détermine la rétraction des éléments, surtout des hématoblastes et produit la précipitation partielle, sous forme de fines granulations, d'un des principes albuminoïdes du sang.

Cet effet a même pour conséquence, toutes les fois qu'il existe chez un individu malade une lésion inflammatoire avec augmentation de la fibrine, d'entraîner la formation dans le mélange sanguin d'amas qui seront décrits plus tard sous le nom de plaques phlegmasiques. Le liquide A ne peut donc être utilisé ni pour la numération des hématoblastes, ni pour celle des autres éléments

du sang, lorsqu'il existe une augmentation de la fibrine.

Le sérum iodé de Max Schultze, quand il est bien réussi, n'a pas ces inconvénients ; c'est lui qui m'a servi dans mes études sur le sang de l'homme à l'état pathologique, soit pour faire le dénombrement des éléments dans le sang phlegmasique, soit pour étudier les variations numériques des hématoblastes. Mais pour poursuivre mes recherches sur les animaux et en particulier sur le chien, j'ai dû recourir à un autre liquide.

Je l'ai trouvé dans l'urine diabétique. Celle-ci est surtout favorable lorsque les malades sont atteints à la fois de glycosurie et d'azoturie, que leur urine marque plus de 1,039 au densimètre et contient au moins 40 grammes de sucre par litre.

Pour conserver cette urine sucrée, on met à profit les propriétés antifermentescibles de l'eau oxygénée signalées par P. Bert et M. Regnard (1). La proportion de 5 à 6 p. 100 d'eau oxygénée à 12° est celle qui convient le mieux. Cette urine diabétique et oxygénée que je désignerai, pour la commodité de la rédaction, sous le nom de liquide B, doit être conservée dans des flacons bien bouchés et placés dans un endroit frais ; on en prendra au fur et à mesure des besoins quelques grammes seulement dans une petite bouteille.

Pour éviter les moisissures qui peuvent se former pendant l'été à la surface du liquide et sur le bouchon, on mettra un petit morceau de camphre dans chaque flacon.

Le seul inconvénient que présente ce liquide consiste dans le dégagement de fines bulles d'oxygène qui se forment au moment où l'on fait le mélange avec le sang et qui peuvent gêner la numération des éléments.

Lorsqu'on s'en tient au dénombrement des hématies et des globules blancs, on fait usage du liquide A. On lui a reproché de produire des amas de globules et de ne pas se prêter à une égale répartition des éléments. Cependant, dans le sang non phlegmasique, je n'ai jamais observé d'amas globulaires; j'attribue les mauvais résultats obtenus par d'autres observateurs à l'emploi d'un liquide probablement mal préparé ou mal conservé. Toutefois, je crois devoir indiquer ici le liquide préconisé récemment par M. Bouillard, parce qu'il donne également de bons résul-

(1) P. Bert et Regnard, Action de l'eau oxygénée sur les matières organiques et les fermentations (Comptes rendus de l'Acad. des sciences, 22 mai 1882).

tats (1). On l'obtient en mélangeant deux tiers de sérum artificiel de M. Malassez avec un tiers de liquide A.

Le sérum de M. Malassez est préparé de la manière suivante :

Gomme très Manche 8 grammes.

Eau distillée 100 centimètres cubes.

Dissolvez.

Chlorure de sodium 3 grammes.

Eau distillée i 00 centimètres cubes.

Dissolvez.

Sulfate de soude 5 grammes.

Eau distillée 100 centimètres cubes .

Dissolvez.

Ces trois solutions doivent avoir une densité de 1,022 ou marquer 3° Baume.

Mêlez les deux dernières solutions et ajoutez à 265 centimètres cubes du mélange 65 centimètres cubes de la solution de gomme.

D'après M. Bouillard ce sérum artificiel doit être filtré et abandonné longtemps au repos, avant d'être employé ; on doit également avoir le soin de laisser surnager à sa surface un morceau de camphre qui préviendra la fermentation.

Cette solution, qui a été utilisée pendant plusieurs années par M. Malassez, déforme les hématies de l'homme et exerce une action destructive très notable sur celles des animaux (lapin, chien). Elle ne doit jamais être employée seule; mais lorsqu'on la mélange avec un tiers de liquide A, comme le propose M. Bouillard, on obtient effectivement un nouveau liquide quej 'appellerai liquide C, à l'aide duquel on peut parfaitement effectuer la numération des globules rouges et blancs. Il fixe moins complètement l'hémoglobine que le liquide A et rétracte moins les éléments du sang ; il ne se prête cependant pas à la numération des hématoblastes pour laquelle il faudra recourir soit au sérum iodé, soit au liquide B.

Ces deux derniers liquides n'ayant pas une composition invariable sont assez souvent défectueux. J'ai donc tenté, dans ces dernières années, de substituer au liquide iodé de Max Schultze du liquide amniotique conservé à l'aide d'eau oxygénée. Le liquide amniotique du mouton, additionné de 6 p. 100 d'eau oxygénée à 12°, donne de bons résultats. J'ai également recueilli dans des ballons Pasteur des liquides amniotiques de la vache et du

(1) Bouillard, Étude pratique sur la numération des globules du sang (Recueil des mémoires de médecine, de chirurgie et de pharmacie milit., juillet-août 188*2).

mouton pour les conserver purs et les utiliser au fur et à mesure des besoins. On devra toujours avoir à sa disposition, pour les études hématologiques, un certain nombre de ces ballons préparés avec beaucoup de soin pendant les mois les plus froids de l'hiver.

Les liquides amniotiques, oxygénés ou non, peuvent être additionnés, au moment ou l'on s'en sert, d'une petite quantité de solution très concentrée de violet de méthyle o B. Cette matière colorante facilite le dénombrement des hématoblastes et des globules blancs.

La cellule destinée à recevoir la petite portion du mélange qui

Fig. 9. — Cellule de l'hématimètre.

sera soumise à l'examen microscopique est formée simplement par une lamelle de verre mince, perforée à son centre (de manière à présenter un trou d'environ 1 centimètre de diamètre) et collée sur une lame de verre porte-objet parfaitement plane.

Cette lamelle est usée à l'émeri d'une manière bien égale partout jusqu'à ce qu'elle atteigne une épaisseur déterminée avec précision à l'aide du sphéromètre.

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Fig. 10. — Coupe schématique de la cellule de l'hématimètre.

A, lame plane; B, lame perforée à surface dépolie; C, lamelle plane; a, couche du sang dilué; 6, anneau d'air régnant autour du mélange sanguin.

Lorsqu'on dépose dans une cellule de ce genre une goutte de liquide et qu'on la recouvre ensuite d'une lamelle de verre bien plane qui vient reposer sur les bords de la cavité, on transforme la goutte en une lame de liquide à surfaces parallèles d'une épaisseur uniforme et connue, en même temps qu'on ferme la cavité cellulaire (fig. 9 et 10).

Mais il importe de remarquer que la goutte de liquide à examiner, placée au milieu de la cellule, ne doit pas être assez vo-

lumineuse pour la remplir totalement. Après son aplatissement en lame, elle doit être entourée d'un anneau d'air complet, afin que la lamelle ne soit pas soulevée par une quantité surabondante de liquide. On se souviendra donc toujours que la cellule doit donner une épaisseur connue du mélange sanguin et non un certain volume (fig. 10). En outre, on aura grand soin de ne jamais remplacer la lamelle plane C par une lamelle ordinaire. Le volume qu'on cherche à circonscrire est complété par la glace quadrillée placée dans l'oculaire. Sur cette glace qui doit être fixée solidement entre le verre de champ et le verre de l'œil est gravé un grand carré divisé en seize parties égales; de plus,

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Fisr. 11

pour faciliter la numération on a tracé, dans les seize petits carrés, des lignes réciproquement perpendiculaires qui n'en atteignent pas les bords (fig. 11).

On sait qu'à l'aide d'un micromètre objectif il est facile de calculer, pour un grossissement donné, la valeur du carré ainsi disposé. Sur le tube rentrant du microscope, on marque un trait d'affleurement lorsqu'avec l'objectif dont on se sert habituellement (n° 5, Nachet, ancien 2), le côté du carré représente un cinquième de millimètre.

Lorsqu'on emploie, comme on le fait d'ordinaire, une cellule dont la hauteur est également d'un cinquième de millimètre, le dispositif décrit met sous les yeux de l'observateur la projection

d'un cube d'un cinquième de millimètre de côté. Il suffit alors de compter les éléments compris dans l'intérieur du grand carré, c'est-à-dire des seize petits, pour connaître le nombre d'éléments contenus dans ce volume de mélange sanguin.

A l'aide de ces données, il devient très facile de déterminer le nombre des globules compris dans un millimètre cube de sang pur.

Habituellement, pour faire le mélange on prend 500 millimètres cubes de sérum et 2 millimètres cubes de sang. Mais comme le mouillage de la pipette à sérum est de 6 millimètres cubes, on n'a en réalité déposé dans l'éprouvette que 494 millimètres cubes de sérum, ce qui, avec les 2 millimètres cubes de sang, fait au total 496 millimètres cubes de liquide. La proportion du sang dans le mélange est donc de 2/496 ou 1/248. Il faudra donc multiplier le chiffre des éléments trouvés dans le grand carré par 248, titre du mélange. On aura ainsi le nombre des éléments renfermés dans un cube d'un cinquième de millimètre de côté. Comme 1 millimètre cube contient 125 cubes d'un cinquième de millimètre, le produit précédemment trouvé devra être multi-' plié encore par 125. On voit donc que, pour obtenir le chiffre des éléments contenus dans un millimètre cube de sang pur, le nombre fourni par la numération dans le grand carré doit être multiplié successivement par 248, puis 125, c'est-à-dire par le multiplicateur constant 31 000 = 248 X 125.

Ce procédé simple et expéditif a donné lieu à quelques critiques; mais il est à remarquer que tous les expérimentateurs qui l'ont trouvé fautif sont partis de vues exclusivement théoriques pour en dénier l'exactitude. Tous ceux, au contraire, qui s'en sont servis en employant des instruments soigneusement faits et un sérum irréprochable ont eu à s'en louer et ont obtenu dans leurs diverses expériences des chiffres concordants. Aujourd'hui je me crois en mesure d'affirmer qu'il donne de bons résultats et que les seules erreurs auxquelles il expose sont toutes personnelles et tiennent à quelque imperfection dans le procédé opératoire.

Le meilleur témoignage que l'on puisse invoquer en sa faveur c'est que, de divers côtés, on a cherché à l'imiter. Comme ces soidisant perfectionnements ne constituent à vrai dire que des complications sans utilité pratique, il serait oiseux de s'en occuper ici.

Je ferai cependant exception pour la modification imaginée

G. Hayem. — Du Sang. 3

TECHNIQUE

par un auteur anglais, Gowers (1). Les microscopes anglais se prêtent moins bien que les nôtres à l'emploi du dispositif que demande notre procédé, surtout en ce qui concerne l'emploi de l'oculaire quadrillé. Afin de supprimer le trait d'affleurement et l'oculaire quadrillé, Gowers a eu l'idée de graver au fond de la cellule

Fig. 12. — Platine spéciale pour la numération avec l'objectif quadrillé et la cellule

de l'hématiniètre.

les divisions qui doivent servir à faire la numération. Malheureusement cette innovation est, en fait, d'une réalisation fort difficile. En premier lieu, l'opération qui a pour but de planir le fond de la cellule rend le verre extrêmement fragile, et quand on y applique la machine à diviser pour dessiner les carrés, il se produit des

Fig. 13. — Coupe de l'appareil précédent.

C, platine du microscope ; B, objectif quadrillé portant une plaque P dont les divisions vont se projeter sur le fond de la cellule 0 ; L, lame de la cellule ; V, lamelle de la cellule.

éclats nombreux, si bien que les raies ne sont pas nettes. De plus, la réfringence du verre égalant à peu près celle du liquide qu'on place dans la cellule, les divisions sont à peine visibles au moment

(1) Gowers, Ou the numération of blood corpuscles {Lancet, II, p. 797, 1877).

de la numération. Enfin, toute erreur résultant de l'imperfection delà machine à diviser, et celle-ci n'est jamais parfaite, est multipliée par le grossissement, c'est-à-dire par 150 ou 300 fois, ce qui enlève aux résultats l'exactitude désirable.

Cependant il y avait dans l'innovation de Gowers une idée dont M. Nachet, avec l'ingéniosité dont il nous a donné tant de preuves, vient de tirer un excellent parti. Par un jeu de lentilles spécial, une sorte d'objectif, il arrive à transporter sur le fond de la cellule l'image d'un quadrillé photographié sur verre (fig. 13). En vissant cet appareil sous une platine spéciale superposée à celle du microscope (fig. 12-13), on obtient au fond delà cellule une image fixe du carré, de sorte qu'en déplaçant la cellule on fait passer sous les yeux une série de carrés. Dès lors l'oculaire quadrillé et le trait d'affleurement sur le microscope deviennent inutiles, et on peut employer un grossissement quelconque sans changer la valeur de la surface dans l'étendue de laquelle on compte les éléments.

Evidemment, ce nouveau dispositif ne modifie le principe du procédé en aucune façon ; c'est une simplification qui peut avoir son utilité. Elle permet d'employer l'hématimètre avec tous les modèles de microscopes.

§ 2. — Manière d'opérer; précautions a prendre.

A. Numération des globules rouges. — La numération des éléments du sang n'exige pas un long apprentissage. Mais pour obtenir de bons résultats il faut prendre un certain nombre de précautions que nous allons préciser en formulant la manière de conduire l'opération.

Après avoir disposé sur une table bien horizontale les instruments nécessaires et avoir rentré le tube du microscope jusqu'au trait d'affleurement, on prend à l'aide de la grosse pipette (fig. 8, A) 500 millimètres cubes de sérum artificiel que l'on dépose dans l'éprouvette de façon à vider la pipette le plus complètement possible.

Le doigt choisi pour la prise de sang, ayant été préalablement bien nettoyé et séché, on en pique la pulpe à l'aide d'une lancette; on presse doucement en arrière de la piqûre, et au fur et à mesure que le sang sort on l'aspire avec la petite pipette munie de son tube de caoutchouc (fig. 8, B), jusqu'à ce que la colonne de sang

dépasse le trait marqué 2; on essuie rapidement, avec une peau de chamois bien souple, l'extrémité de la pipette et on souffle très doucement dans le tube de caoulchouc jusqu'à ce que la colonne sanguine arrive exactement au trait d'affleurement. Le sang en excès qui sort à l'extrémité de la pipette est enlevé au fur et à mesure par la peau de chamois, ou à son défaut par la pulpe bien sèche d'un des doigts de la main gauche.

Cette partie de l'opération, aspiration du sang et affleurement, doit être faite avec beaucoup de précision et aussi rapidement que possible ; elle ne doit pas demander une minute. On plonge alors l'extrémité de la pipette dans le sérum déposé dans l'éprouvette et, en soufflant doucement, on chasse toute la colonne sanguine. Pour bien vider la pipette on aspire deux ou trois fois de suite un peu de sérum qu'on repousse aussitôt dans l'éprouvette sans retirer la pipette du sein du liquide. Pendant tout ce temps, c'est-à-dire depuis le moment où l'on aspire le sang jusqu'à ce que la pipette soit bien libérée, on conserve entre les lèvres l'extrémité libre du tube de caoutchouc, de manière à pouvoir constamment, sans perdre de temps, aspirer ou souffler. On abandonne alors la pipette et on plonge la palette dans le mélange. En faisant rouler le manche de cet agitateur entre les doigts, on lui imprime un rapide mouvement de va-et-vient qui assure en quelques secondes une bonne répartition des éléments.

La cellule et la lamelle préparées à l'avance sont alors nettoyées une dernière fois avec un pinceau fin bien dégraissé, afin qu'entre les lames de verre qui vont être mises en contact, il ne reste aucune trace de poussière.

Sans perdre de temps et tout en continuant à agiter la palette, on dépose une goutte du mélange au milieu de la cellule. Avec un peu d'habitude on parvient facilement à donner à cette goutte un volume convenable et à la rendre libre de toute bulle d'air.

Dès que la goutte est déposée dans la cellule, on prend entre le pouce et l'index de la main droite la lamelle préalablement bien nettoyée et mise à la portée de la main et on la laisse tomber doucement et d'aplomb sur la goutte. Il ne reste plus qu'à réunir la lamelle couvre-objet et la cellule avec un peu de salive.

Ce liquide, déposé en très petite quantité sur les deux bords opposés de la lamelle, s'infiltrant par capillarité entre les deux plaques de verre, s'opposera au glissement de la lamelle et à l'évapo-

ration de la goutte. Celle-ci doit se trouver isolée au centre de la cellule et entourée d'un anneau d'air complet. Pour faciliter la pénétration de la salive, on appuie perpendiculairement sur les quatre coins de la lamelle sans la faire glisser et on enlève l'excès de salive qui soulèverait la plaquette et rendrait la préparation défectueuse.

Au bout de quelques instants, les globules, grâce à leur densité, tombent au fond de la cellule et y restent adhérents. Il faut pendant ce temps que la cellule séjourne sur un plan bien horizontal. Il ne reste plus qu'à compter les globules compris dans le grand carré de l'oculaire. Pour éviter toute erreur, on devra s'habituer à suivre toujours le même ordre, en dénombrant d'abord ceux qui sont contenus dans l'intérieur du carré, puis ceux qui sont à cheval sur les bords. On ne tiendra compte que de la moitié de ces derniers. Supposons que les premiers soient au nombre de 150 et les seconds de 10, on aura pour chiffre total 155.

Il est nécessaire de faire plusieurs numérations successives, en ayant soin de choisir les régions de la préparation qui paraissent les plus différentes les unes des autres. Ces différences ne sont jamais considérables; quand il y a un écart très accusé entre deux des chiffres obtenus, cela tient à ce que le mélange n'est pas homogène et que la préparation a été mal faite, et dans ce cas on ne doit pas hésiter à recommencer l'opération.

On se contente habituellement pour la numération des globules rouges de compter les éléments compris dans 5 ou 6 carrés; on additionne les chiffres trouvés, on en prend la moyenne et le nombre obtenu est multiplié par 31 000.

Lorsqu'on emploie, au lieu de l'oculaire quadrillé, la platine spéciale, imaginée par M. Nachet, l'opération est sensiblement la même. Après avoir placé convenablement cette platine, on choisit une combinaison d'objectif et d'oculaire qui permette d'apercevoir nettement l'image suffisamment grandie du carré projeté au fond de la cellule. On s'assure que le foyer de la lentille dont on se sert permet facilement le glissement sur la platine de la cellule recouverte de sa plaquette, et on met le microscope au point avant de faire la préparation.

S'il s'agit d'une cellule ayant un cinquième de millimètre de haut, les calculs sont les mêmes.

B. Numération des globules blancs. — Pour faire la numéra-

tion des globules blancs, on emploie le même dispositif; seulement, comme ces éléments sont beaucoup moins nombreux et, de plus, répartis d'une façon irrégulière dans la préparation, il faut les compter clans un plus grand nombre de champs.

Voici comment je conseille d'opérer :

On conduit avec la main la petite préparation, jusqu'à ce qu'un des bords de la goutte soit sous-tendu par le grand carré, par le bord gauche, par exemple ; puis, après avoir noté l'absence ou la présence de globules blancs, on déplace la préparation de façon à ce que les globules rouges à cheval sur le bord droit du grand carré soient vus à cheval sur le bord opposé, le bord gauche. On a ainsi fait parcourir à la préparation l'espace d'un carré. On examine de la sorte tous les carrés successifs contenus dans une bande transversale ; puis on répète la même manœuvre pour une bande perpendiculaire à la première. On additionne les chiffres trouvés, on en prend la moyenne qu'on multiplie par 31000.

C. Numération des hématoblastes. — Enfin, la numération des hématoblastes demande un dispositif spécial. Il faut employer un grossissement plus fort, se servir d'un objectif 6 Nachet (ancien 3) au lieu de l'objectif 5, et d'un plus grand quadrillé. La cellule doit avoir un dixième de millimètre de hauteur, et être recouverte par une lamelle plane suffisamment mince ; dès lors on ne compte plus les éléments dans un cube ayant 1 cinquième de millimètre de côté, mais dans un parallélipipède ayant une base de 1 cinquième de millimètre et une hauteur de 1 dixième de millimètre.

Afin de simplifier les calculs, et de pouvoir employer le même numérateur que pour les globules rouges, 31 000, il convient de prendre une quantité double de sang, c'est-à-dire 4 millimètres cubes. La numération des hématoblastes sera faite dans une quarantaine au moins de carrés, en même temps que celle des globules blancs.

On peut donc arriver rapidement à compter les divers éléments figurés contenus dans un millimètre cube de sang. Etant données les moyennes ainsi recueillies pour les globules rouges, les globules blancs et les hématoblastes, cette évaluation se fait par un calcul fort simple. Prenons un exemple :

1° Globules rouges. — Moyenne des éléments renfermés dans 5 à

6 grands carrés, 165. En multipliant 165 par 31 000, on a 5115000:

2° Globules blancs. — Dans 58 grands carrés compris dans les deux zones réciproquement perpendiculaires on a trouvé 9 globules blancs : la moyenne est 9/58, qui, multiplié par 31000, donne 4 805.

3° Hématoblastes. — Moyenne 11. En multipliant par 31 000, on a 341 000.

Le millimètre cube de ce sang renferme 5115 000 globules rouges, 4805 globules blancs, 341 000 hématoblastes.

Il ne reste plus qu'à indiquer les précautions à prendre pour maintenir en bon état les petits instruments précédemment décrits.

La cellule, la plaquette destinée à la recouvrir et la pipette à sérum doivent être nettoyées simplement avec de l'eau distillée et essuyées avec un linge fin, non pelucheux. La pipette destinée à prendre le sang sera nettoyée successivement avec une solution de soude ou de potasse, de l'eau distillée, puis de l'alcool absolu ou de l'éther. On aspirera donc successivement ces divers liquides jusqu'au-dessus de la chambre à air pour les chasser bientôt après. Lorsqu'on viendra de repousser la petite colonne d'alcool, on aspirera alors par le tube de caoutchouc l'air extérieur jusqu'à, ce que le tube capillaire soit complètement sec.

Il arrive assez fréquemment, surtout lorsqu'on n'a pas l'habitude de l'opération, de laisser cette pipette se boucher par suite de la coagulation du sang qu'elle contient. Il suffit pour la déboucher de la laisser tremper pendant quelque temps dans un tube à essai rempli de solution de potasse, puis d'y passer un fil de platine.

Pour faciliter les calculs, on peut se servir des tableaux suivants :

Tableau pour le calcul des globules rouges.

GLOBULES

NOMBRE DES GLOBULES

GLOBULES

NOMBRE DES GLOBULES

CONTENUS

par

CONTENUS

par

dans le carré.

MILLIMÈTRE CUBE

dans le carré.

MILLIMÈTRE CUBE

2 232ÔI.0

4 433 uOO

GLOBULES

NOMBRE DES GLOBULES

GLOBULES

NOMBRE DES GLOBULES

CONTENUS

par

CONTENUS

par

dans le carré.

MILLIMÈTRE CUBE

dans le carré.

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