C. Exactitude de la méthode spectrophotométrique

Le degré d’exactitude que comporte cette méthode dépend ; 1“ de l’exactitude avec laquelle on peut déterminer d’abord la constante A de la substance à doser et ensuite le coefficient d'extinction de la solution à analyser; 2“ du degré de précision que l’on atteint dans la préparation des liquides colorés (mensuration ('t dilution des liquides). — Examinons successivement ces deux points.

Les appareils qui ont été étudiés avec le plus do soin au point de vue de.<causes d’erreur que comporte leur usage sont ceux de Vierordtet Ilüfner. Ce sont, comme on l'a vu, des spectrophotomètres à faisceaux juxtaposés. Les appareils de ce genre permettent, en général, d’apprécier l’égalité d'intensité de deux plages avec une approximation qui varie de à C’est dans la région du jaune que la sensibilité est maxima. Elle diminue beaucoup dans le violet, surtout poulies appareils à vision directe (2). L’intensité absolue des lumières à comp«ire.i semble avoir moins d’influence. Elle doit être choisie telle que l’œil puisse supporter ses examens réitérés sans trop de fatigue. Il semble d’ailleurs qu’il y ail jiour chaque couleur spectrale une valeur absolue des intensités observées pour lesquelles la sensibilité est maxima.

Mais admettons que l’approximation moyenne de l’observation photométfiqur

soit de Ce renseignement suffit-il pour calculer l’erreur maxima que com- Iiortcra l’examen d’une solution colorée quelconque par voie spectrophotomi'- Irique? Il n'en est rien. Et d’abord on conçoit aisément que les solutions plus concentrées, c’est-à-dire exerçant un effet absorbant plus énergique, se prêtent à des déterminations photométriques plus exactes. En effet, Vîerordt a montré expérimentalement que les plus petites différences relatives de concentrations encore révélées par le spcctrophotomètre sont en raison inverse des concentrations. En outre, à concentrations égales, les matières colorantes exercent des effets absorbants d'une intensité très variable, ce qui revient à dire que leur spectre est plus ou moins favorable à des déterminations quantitatives exactes. Enfin, la préparation des liqueurs titrées des diverses matières colorantes, opération indispensable pour la détermination de la constante d’absorption A. comporte également une exactitude variable selon l’altérabilité de la substance, les conditions de sa préparation à l’état de pureté, etc...

(Ij Trannin, Mesures photométriques, m Journ, de phys., 1876, t. V, p. 297,

(2) VoirCrova: Ann. de Cliiin. et de Phys., 5' série, t. XXIX, 1883, p. S.57.

iü ENCYCLOPÉDIE CHIJIKJUE. — GARNIER ET SCHLACDENHAUFFEN.

Pour toutes ces raisons, il convient d’étudier la valeur de la méthode dans chaque cas particulier, c'est-à-dire pour chaque substance et pour des concen- Irations variant dans des limites assez étendues pour comprendre les cas que présente pratiquement le dosage de la substance en question.

Une telle étude a été faite avec beaucoup de soin pour l'oxyhémoglobine, par Hüfner (I) et ses élèves. Le dosage de cette matière colorante, qui représente l’application la plus importante de la méthode spectrophotométrique à la chimie biologique, est, par la nature des difficultés qu'il présente, un exemple bien choisi pour montrer ce que vaut pour le chimiste biologiste la méthode en ijucstion. Or J. Otto (2), qui a repris récemment cette question, a fixé, par une série de déterminations (3), les valeurs des rapports d'absorption A„ et A'^ de l’oxyhémoglobine dans deux régions spectrales et a montré que ces grandeurs qui sont

Pour .Ao. 0,001880

ne sont entachées que d’une erreur moyenne de =b0,64 p. 100 pour .4^ et de ±0,92 p. 100 pour A'o (4). Ces résultats ont été obtenus avec un spcctrophotomètre de Ilüfner légèrement modifié. .Avec celui de Vierordt, les résultats sont moins bons, bien qu’ils restent très supérieurs à ceux que fournissent les autres méthodes de dosage de l’hémoglobine. On peut donc affirmer que les constantes en question sont déterminées avec une exactitude très suffisante, et par conséquent aussi que la fixation du coefficient d’extinction des solutions colorées est susceptible d’une très grande précision. Enfin, si on veut apporter un soin très minutieux à la dilution des liquides colorés que l’on doit opérer à l'aide de pipettes très exactement jaugées à l'aide du mercure, on arrive à des résultats entachés d’une erreur qui est d'environ 1 gramme à l6‘-,20 pour 100 grammes d’hémoglobine. .Sur les 14 grammes d’hémoglobine que contiennent en général, chez l'homme, 100" de sang, on commettra donc, avec l'appareil de Hüfner, une erreur moyenne de 0*'V14 à 0s^^6 {»).

Les appareils à faisceaux juxtaposés, ou tout au moins celui de Vierordt et surtout celui de Hüfner, conduisent donc à des résultats remarquables, bien

(I) Hüfner, Journ. f. prakl. Chem., I. XVI, 18'7, p. 291, et v. Noonlen, Zeitschr. f. ph,jmol. Chem., t. IV, 1880, p. 8.

(â) J. Otto, Arch. f. d. ifesamt. Phjüol., t. XXXVI, 1883, p. 12.

(3) Voy. p. 1* et p. 169.

(i) Si l’on veut appliquer rigoureusement les règles du ealeul des probabilités, on arrive même "a ce résultat que l’erreur probable n'est pour Aj, que de 0,21 p. 100, et pour A'o de 0,2i p. 100. (Otto, loc. cit.)

(5) Si l'on veut se rendre compte de l'importance que la méthode spectrophotométrique a prise dans ces dernières années dans les études biologiques, il suffit de se reporter an\ nond'reuv mémoires publiés notamment |)ar Hüfner et ses élèves (Hüfner, Journ. f. prakt. Chem., t. XVI, 1877, p. 291; t. XXII, p. 362. 1880, et Zeilschr. f. phijsiol. Chem., t. I, p. 390. 1877; t. III, p. l et t. VI, p. 94. — Otto, Ibid., t. Vil, p. 57. — Branly, Thèse, Paris, 1882. — Lambling, Thèse, Nancy, 1882. — Hüfner et Otto, Ibid., t. VII, p. 65. — Hüfner et Küh, Journ. f. prakl. Chem., t. XXVllI, p. 256, et Zeitschr. f. physiol. Chem., t. VII, p. 366. — J. Otto, Pflügers Archiv, t. XXXI, p. 240 et p. 24.5. — J. Marschall, Zeitschr. f. physiol. Chem., t. VU, p. 81. — Külz' Ibid , t. VU, p. 384. — Hüfner, Ibid., t. VIII, p. 3.58 et p. 366. — Le même, Journ. f. prakt. Chem., nouvelle série, t. XXX, p. 69, etc...). — Lambling, .irch. de Physiol. 1888