MORPHOLOGIE ET BIOLOGIE DU BACILLE ICTÉROÏDE. DIAGNOSE

BACTÉRIOLOGIQUE RAf'IDE DU MÊME BACILLE

Le bacille ictéroïde se cultive facilement dans tous les milieux nutritifs artificiels communs, solides et liquides, dans lesquels il se présente sous l'aspect d'un bâlonnet aux pointes arrondies, le plus souvent réuni en couples, d'une longueur de 2 à4 [JL et en général deux fois plus long que large. Cependant celte forme varie dans de certaines limites, suivant le milieu nutritif, l'âge, etc.

Il se colore facilement avec tous les liquides colorants ordinaires, mais il ne résiste pas à la méthode de Gram.

La coloration des cils, par la méthode de Nicolle-Morax, démontre la présence de cils vibraliles longs et nombreux (4-8).

11 est anaérobio facultatif. Avec la méthode de Leyal- Wcijl, on n'obtient pas la réaction bleue de ïindol; avec la méthode de Kitasato, on la voit apparaître très faible.

i° Cultures sur plaques de gélatine. — Le dévelojipement en colonies distinctes, à la surface ou dans l'épaisseur des plaqués de gélatine, constitue pour le bacille ictéroïde un élément diagnostique d'une grande valeur.

Si on maintient les cultures à la température d'environ 20",

ou voit déjà, après 24 heures, et à un faible grossissement, des colonies piincli formes ayant l'aspect et les dimensions des leucocytes du sang. Elles sont, en elfct, arrondies, transparentes, incolores, sans noyau, et constituées par une granulation très fine et brillante. Elles ne lluidifieiit jamais la gélatine.

Lorsqu'elles sont très nombreuses et très rapprochées, elles cessent de croître; mais ne conservent pas leur aspect, et le plus souvent, après 6 ou 7 jours, elles commencent à devenir opaques et finissent par se transformer en autant de points noirs, tout à fait impénétrables à la lumière.

Si, au contraire, les colonies se développent en surface et un peu éloignées les unes des autres, elles continuent à augmenter de volume et deviennent sphériques, en gardant toujours leur aspect brillant et granuleux.

Peu à peu commence presque toujours à apparaître un noyau plus ou moins foncé, plus ou moins grand, central ou périphérique, mais toujours entouré d'un halo clair, d'oià partent de fines granulations qui s'irradient vers la périphérie, où elles disparaissent régulièrement, en une très délicate et élégante nuance.

Arrivée à ce point, c'est-à-dire vers le 5® jour, la colonie présente un aspect tellement caractéristique que, une fois connu, on ne peut l'oublier.

Observées à l'œil nu, les colonies apparaissent, à la lumière directe, avec un aspect laiteux, sans irisation, et à la lumière réfléchie, d'une couleur gris cire.

Par transparence et à cause de sa parfaite opacité, on distingue très bien et à l'œil nu le petit noyau.

Souvent, les colonies ne forment pas de sphères régulières; bien au contraire, elles sont déprimées d'un côté oii se forme une espèce de hile contenant le noyau; dans ces cas, la colonie prend un aspect réniforme très caractéristique.

Dans des cas exceptionnels, la surface de la colonie n'est pas constituée par ces granulations fines, uniformes et brillantes que nous avons décrites plus haut, mais elle prend une élégante disposition radiaire et ondulée qui, divergeant du centre, finit par s'effacer régulièrement à la périphérie en une très légère et imperceptible nuance.

L'aspect de ces colonies radiolées atypiques est si difTérente

de l'aspect commun décrit plus haut, qu'il faut le bien connaître, pour éviter les erreurs de diagnostic possibles et même faciles.

Même ce petit centre germinatif, opaque, auquel nous do nnons vulgairement le nom de noyau de la colonie, ne conserve pas toujours la forme sphérique; il prend très souvent, surtout lorsque sa situation correspond à la dépression d'une colonie réniforme, la forme d'une sphère située au milieu d'un cercle (telle que la figure connue de la planète Saturne), et ressort d'une manière particulière par son aspect noir. Il est rare de trouver des colonies sans noyau ou ayant deux noyaux périphériques.

Mais, quelle que soit la forme prise par la colonie pendant son développement, il est de règle qu'elle ne conserve pas longtemps l'aspect indiqué.

A mesure qu'elle vieillit, c'est-à-dire à partir du 5" ou 6« jour, l'aspect brillant de sa granulation commence peu à peu à se troubler, devient opaque, lance des reflets noirâtres et finit par devenir tout à fait noir, gardant seulement une petite zone ronde et transparente au milieu de laquelle se dessine encore le petit noyau avec une parfaite netteté.

Quand il s'agit de colonies développées dans l'épaisseur de la gélatine plutôt qu'à sa surface, l'opacité survient beaucoup plus vite, et, observées à un faible grossissement, elles apparaissent comme de petites sphères de couleur noire, comparables à des gouttes d'encre.

Cette tendance spéciale des colonies à l'opacité plus ou moins complète, constitue un autre élément important pour reconnaître sur gélatine le bacille ictéroïde, au milieu d'autres microbes qui se seraient accidentellement développés à côté de lui.

Toutefois, il faut remarquer à cet égard que les colonies qui se développent dans la gélatine ne présentent pas toujours le type morphologique fondamental ci-dessus décrit.

Dans certaines plaques de gélatine où, soit par l'effet de la température, soit pour d'autres causes, le développement des colonies s'effectuait fort tardivement et avec une certaine difficulté, j'ai vu assez fréquemment ces dernières présenter, dès le commencement, des formes complètement atypiques, tant par l'aspect que par la couleur.

Ces formes atypiques apparaissent aussi quelquefois dans certaines cultures qui se sont développées normalement, ou lorsqu'elles commencent à vieillir ' Dans ce dernier cas, après environ 8-10-20 jours de vie, les colonies commencent à éprouver une lente et graduelle transformation, prennent une teintef jaunâtre ou brunâtre, disposent leur surface par couches ou^anneaux concentriques, formant des dessins en rosette, en gazon, en losange, et laissent apparaître des noyaux étoilés, des entrelacements réticulaires ; en nn mol, elles donnent lieu à une série de formes tout à fait étranges, qu'il est impossible de décrire en détail.

Ce pléomorphisme pourrait amener des confusions faciles, en particulier avec les nombreuses variétés du coli-bacille. C'est pourquoi j'ai cherché quelques caractères différentiels, susceptibles d'être appliqués rapidement, et que voici résumés :

i° Le développement du bacille ictfiroïde sur les plaques de gélatine doit s'obtenir à une température supérieure à 20° C;

2° Lorsque, pour une cause quelconque, le développement régulier des colonies à la surface de la gélatine ne commence pas à s'effectuer après les premières 36-48 heures, on doit s'attendre à un développement atypique tardif;

3° Ce pléomorphisme tardif du bac. ictéroïde se distingue du pléomorphisme présenté par les colonies du coli-bacille, en ce que celui-ci a lieu constamment et en conditions normales. J'ai suivi, à travers plusieurs générations sur de la gélatine, cinq variétés de coli-bacille isolées de l'estomac et de l'intestin de sujets morts de fièvre jaune. Elles présentaient, au début, des formes peu distinctes les unes des autres; mais déjà, dès les premières générations, parurent dos colonies pléomorphes ettout à fait dillérentes des types primitifs. Ces colonies nouvelles furent successivement transportées sur d'autres plaques, et, à chaque

i. Je crois devoir remarquer ici que celte description morphologique date de mes premières observations. Mes études ultérieures m'ont démontré que la vie de laboratoU^e produit des changements, parfois très profonds, dans la physionomie initiale des colonies développées sur plaquus de gélatine.

Des recherches ultérieures permettront d'établir ju?(iii'oii peut aller ce p/éomorphisme de faboratoiî'e.

Actuellement je crois que la description morphologique que je viens de donner est, à la rigueur, seulement applicable aux microbes récemment isolés du malade de fièvre jaune ou de son cadavre.

nouvelle génération, il se reproduisit des (iguros toujours nouvelles ;

4° Un caractère invariable, différentiel des colonies sur gélatine du bacille ictéroïde de celles du coli-bacilk, résulte de ce que les premières sont toujours incolores et deviennent peu à peu opaques, sans avoir jamais pris cette couleur brunâtre châtain, plus ou moins intense, qui caractérise indistinctement toutes les colonies coli-bacillaires, même dans la première période de leur développement.

Cet élément différentiel servira naturellement dans les diagnostics hâlifs, car si l'on attend que les colonies du bacille ictéroïde, poussées à la surface de la gélatine, aient atteint leur complet développement, en prenant cet aspect sphérique ou rùiiiforme, - à noyau incolore ou noirâtre et fînemeut granuleux, décrit plus haut, aucune confusion n'est plus possible avec les formes bien connues de cratère, de feuille de vigne, de m£r de glace, etc., présentées par les innombrables variétés du coli-bacille.

Du reste, nous verrons plus tard que, contrairement à ce qui s'observe pour le choléra, pour la fièvre typhoïde et plusieurs autres maladies infectieuses, la culture sur plaque de gélatine n'est pas le meilleur procédé pour établir exactement la diagnose bactériologique du bacille ictéroïde.

2o Cultures sur la gélatine solidifiée. — a) Les cultures obtenues par piqûre n'offrent rien de vraiment caractéristique. A la surface et autour du trajet de la piqûre, le bacille ictéroïde se développe lentement, sous forme d'un petit disque, presque transparent comme une goutte de mucosité, et avec peu de tendance à s'étendre.

Quelquefois le développement en surface reste complètement rudimeutaire ou manque tolalemenl. Le trajet ju-ofond du fil de platine apparaît au contraire nettement, sous forme d'un ruban, constitué par de très fines sphères opaques, qui ne confiuent jamais et se présentent plus grandes et plus distinctes sur les bords et à l'extrémité inférieure de la ligne de piqûre.

b) La culture en strie est extrêmement caractéristique, mais dans certaines conditions seulement. Si l'ensemencement est copieux, le développement s'elfectue sur toute la surface, sous

forme d'une fine couche plus ou moins irisée, mais qui ne présente rien de remarquable.

Lorsque, au contraire,, l'ensemencement est pauvre on microbes, fait par exemple avec une trace de sang ou un peu de suc viscéral d'un animal infecté, les colonies sont isolées et apparaissent, après quelques jours, comme de petites perles d'aspect blanc laiteux, sans aucune irisation. Dès que ces petites perles ont atteint un certain degré d'accroissement, elles peuvent s'arrêter et rester stationnaires pour toujours.

Mais, le plus souvent, surtout si les colonies se trouvent assez isolées les unes des autres, un phénomène se produit que nous décrirons plus en détail à propos des cultures sur gélose; c'est-à-dire que les colonies continuent à se développer, coulant vers les parties déclives, et donnant lieu à la formation, de plusieurs traits sinueux qui s'entre-croisent et s'unissent en plusieurs points, descendant vers le fond du tube, comme autant de petites rigoles de blanche cire brillante.

Dans ce cas, la culture prend un aspect si particulier qu'il n'est pas possible de le décrire.

Ces petites rigoles d'aspect cireux, confluant vers le bas, forment peu à peu, au fond du tube, un petit dépôt de substance blanche et luisante. Avec le temps il se manifeste en outre, sur plusieurs points du chemin parcouru par ces rigoles, des veines transparentes qui contrastent sing'ulièrement avec l'opacité laiteuse de la masse fondamentale, et font supposer que la fine pellicule externe opaque s'est fendue en quelques points pour laisser voir la masse sous-jacente, d'aspect de cire et d'une transparence parfaite.

3° Cultures sur gélose. — Contrairement à ce qui se vérifie pour la plupart des microbes pathogènes connus, la culture sur g-élose représente pour le bacille icléroïde un moyen diagnostique de premier ordre, mais seulement dans certaines conditions, que nous allons établir tout de suite.

Si avec l'anse de platine ou avec l'extrémité d'une pipette Pasteur, contenant un peu de sang ou un peu de suc splénique ou hépatique, d'un cadavre ou d'un homme chez qui il n'y a pas eu d'abondantes infections secondaires, on pratique des ensemencements en strie à la surface d'un tube de gélose solidifiée obliquemeut, et si l'on place ensuite ce tube dans l'étuve à 37" G,

ANNAliES DE L'INSTITUT PASTEUll.

on observe après 12-24 heures l'apparition de plusieurs colonies disséminées à la surface du milieu nutritif et plus ou moins éloignées entre elles, suivant la quantité ou le contenu microbien du matériel ensemencé.

Ces colonies n'offrent rien de remarquable. Elles sont arrondies, d'aspect grisâtre, un peu irisées, transparentes, à surface lisse, uniforme, et à marges régulières.

En laissant encore la culture dans l'étuve, les colonies continuent à croître quelque peu de la même manière, jusqu'à ce que, arrivées à un certain point, elles restent stationnuires comme celles de n'importe quelle autre espèce microbienne.

Mais si, après s'être développées, pendant 12-24 heures ou même davantage, dans l'étuve à 37°, on transporte ces cultuies à la température ambiante de 20°-28°, l'accroissement successif des colonies s'effectue d'une manière tellement différente de la première qu'on est forcé de le remarquer tout de suite. En effet, après les premières 8-10 heures, on observe, autour des colonies primitives développées dans l'étuve, la formation d'un bourrelet, qui se distingue immédiatement par son aspect saillant, blanc opaque, à reflets nacrés, et contraste d'une manière très nette avec la partie centrale qui reste toujours plate, irisée et transparente.

Ce phénomène est si net qu'on peut l'observer même à la lumière artificielle, et, une fois connu, il laisse une impression si bien définie que, pour distinguer immédiatement et à l'œil nu une colonie du bacille ictéroïde, au milieu de toutes les autres colonies microbiennes décrites jusqu'à présent, il suffit d'une simple inspection superficielle.

En laissant toujours la culture à la température ambiante, le bourrelet nacré continue à se développer, gardant toujours le même aspect. 11 grossit, devient plus proéminent et finit par entourer la colonie centrale primitive d'une sorte debord ondulé, régulier et faisant fortement saillie.

Une fois arrivées à cette phase du développement, les colonies prennent un aspect vraiment curieux qu'on pourrait comparer à un sceau de cire à cacheter, dont la partie centrale, déprimée, transparente, lisse, légèrement irisée et parfaitement circulaire, est représentée par la colonie qui s'y est développée à la température de l'étuve, tandis que le tow/re/e^ extérieur, très

proéminent, d'une opacité brillante et nacrée, et à contours un peu ondulés, est formé par la seconde phase du développement qui s'est effectuée à la température ambiante.

Quand les colonies se développent très loin les unes des autres, chacune d'elles croît indépendamment et forme son propre 5cmw distinct ; si, au contraire, le matériel ensemencé a été abondant, et si les colonies se développent à l'étuve, bien rapprochées, les bourrelets externes, développés tout de suite à la température ambiante, finissent bientôt par se réunir, et alors l'aspect de la culture tout entière prend un caractère excessivement curieux. Il semble qu'à la surface de la gélose on ait coulé une haute couche de paraffine opaque et qu'ensuite, avec un petit sceau circulaire, on ait pratiqué autant d'empreintes profondes, qu'il y avait de primitives colonies transparentes, circulaires, développées à l'étuve.

Les jours suivants, ce bord extérieur de la culture continue encore à se développer si la température ambiante se conserve favorable entre 20°-22°, et, si les colonies sont séparées entre elles, on observe la manifestation d'un autre caractère biologique intéressant.

Le bourrelet nacré, après avoir formé une espèce de cratère autour de la petite colonie développée à l'étuve, continue à croître en se dirigeant vers les parties déclives du milieu nutritif, oii il tombe lentement sous forme d'un petit ruisselet de térébenthine de Venise.

Si, dans son parcours, ce ruisselet en rencontre d'autres, ils confluent et finissent par former une espèce de filet à mailles irrégulières, qui se dirigent vers le fond, en laisg^nt derrière eux les empreintes profondes des petites colonies développées primitivement à l'étuve.

Mais, arrivées au 10^ jour, les cultures commencent à changer complètement d'aspect.

Tous les bourrelets, tous les ruisselets qui coulaient vers le bas, en somme toute cette partie de la culture qui s'était développée à la température ambiante, prenant cet aspect opaque nacré, déjà décrit, et s'élevanl fortement au-dessus du niveau des primitives colonies développées à l'étuve, commence peu à peu à s'aplatir, presque à se liquéfier, à devenir transparente et, enfin, disparaît presque entièrement, en laissant seulement à

sa place une pellicule très fine et transparente qui en montre les contours passés et en garde l'empreinte.

Tandis que celte étrange métamorphose s'opère dans la partie de la culture développée à la température ambiante, les petites colonies circulaires primitives, développées à 37", deviennent un peu plus opaques, mais restent invariables dans leur forme. Et comme les riches bourrelets externes, aussi bien que les ruisselets qui en sont nés, se sont transformés en une très subtile pellicule transparente, l'aspect final de la culture est comparable à un petit « archipel », où les îles émergeantes à la surface seraient représentées précisément par les mêmes colonies développées les premières 24 heures à l'étuve à 37'', et la surface de Veau par la subtile couche résiduelle de la partie développée à la température ambiante.

Comme il est facile de remarquer, on a alors une figure complètement inverse de celle que nous avons décrite aux premiersjours du développement.

En effet si, après avoir ensemencé le tube de gélose, on le maintient à la température ambiante au lieu de celle de l'étuve, on voit se produire un phénomène opposé à celui qui vient d'être décrit. Les colonies qui apparaissent successivement à la surface de la gélose ne sont pas identiques à celles qui se développent à l'étuve, mais elles paraissent autant de gouttes de lait, à surface luisante, et très relevées. Si la culture est toujours maintenue à la même température, ces gouttes finissent par couler dans les parties déclives, et par se réunir sans présenter rien de caractéristique. Inversement, si, dès que lapelitegoulte d'aspect laiteux se manifeste, on porte la culture à l'étuve, elle apparaît immédiatement entourée d'un nouveau bourrelet, qui, au contraire de celui que nous avons décrit comme se développant à basse température, est plat, transparent et irisé, de sorte que la colonie, au lieu de présenter comme dans le premier cas la forme d'un cratère ou d'un sceau de cire à cacheter, présente celle d'un bouton à noyau central proéminent sur la zone périphérique.

Il est superflu de répéter que, pour la vérification de ces détails morphologiques, il faut toujours employer la gélose solidifiée obliquement en tubes, et semer le matériel en petite quantité, de manière à obtenir le développement des colonies le plus loin possible les unes des autres.

L'ensemencement d'un matériel abondant, en déterminant eneflet le développement de beaucoup de colonies qui confluent rapidement, empêche l'apparition ultérieure du bourrelet caractéristique. Néanmoins, on observe parfois cette apparitionmême autour des cultures confluentes, sous l'aspect d'un fin ruban brillant et opaque qui en suit et délimite les contours extérieurs, à la surface du milieu nutritif.

Comme on le comprend facilement, ces caractères morphologiques présentés par le bacille iclérioide sont entièrement originaux, et ils peuvent être utilisés dans la pratique comme moyen rapkle et sûr pour sa diagnose bactériologique.

Dans ce but, on doit recommander avant tout la dilution la plus complète du matériel d'ensemencement, que celui-ci soit pur ou infecté par la présence de germes de différente nature.

Après avoir exécuté la dilution dans un tube de bouillon stérile, on pratiquera l'ensemencement du matériel, en passant successivement l'anse même de platine à la surface de plusieurs tubes de gélose, ainsi que l'on fait couramment pour le diagnostic bactériologique delà diphtérie \

Le diagnostic bactériologique de la fièvre jaune peut donc être établi en 24-25 heures au plus et sans microscope. Il suffit de constater l'apparition du bourrelet caractéristique.

Le seul inconvénient qu'elle ofïre au point de vue pratique, c'est qu'on n'est pas sûr d'obtenir dans tous les cas, du malade ou du cadavre, un matériel qui contienne le microbe spécifique.

4" Cultures sur le sérum solidifié. — Ce milieu nutritif est peu propice au développement du b. ictéroïde. L'ensemencement effectué avec une anse chargée d'une culture en bouillon, donae

i. Dans mes recherches ultérieures, je me suis aperçu que lorsque les culturts ont passé pendant plusieurs mois à travers des animaux, une partie des colonies qui se développent sur la gélose ne peut plus former son bourrelet nacré caractéristique.

Dans ce cas, c'est seulement un petit nombre d'entre elles qui présente l'aspect décrit plus haut.

Afin de maintenir autant que possible aux colonies ictéroïdes le caractère primitif qu'on observa toujours lorsqu'on les isole des malades ou des cadavres, j'ai l'habitude de cultiver, et d'employer toujours dans les passages successifs, les colonies qui se manifestent avec leur aspect typique complet. Ceci confirme toujours davantage l'extraordinaire tendance au pléomorphisme, manifestée par le bacille ictéroïde sur fous les milieux nutritifs artificiels.

Ea outre, ce plùomorphisme indique qu'on ne peut pas encore considérer comme définitivement achevée l'étude morphologique du microbe de la fièvre jaune.

lieu à la production d'une petite couche luisante, très transparente et à peine visible. L'accroissement est rapide, mais comme il s'arrête après 24 heures, la culture qui en résulte est très mesquine.

Quand on fait l'ensemencement avec un matériel peu abondant, les colonies qui se développent isolément apparaissent comme autant de gouttelettes de rosée, semi-transparentes et à peine perceptibles.

Les préparations colorées des microbes développés sur sérum confirment la mauvaise réputation de ce milieu nutritif. En effet on y observe des formes plus petites qu'à l'ordinaire, arrondies et semblables aux microcoques isolés ou accouplés.

o° Cultures sur pommes de terre. — La pomme de terre ne se .prête pas non plus bien à la culture du bac. ictéroïde. Celui-ci se développe en surface, sous forme d'une fine pellicule transparente, glacée, complètement invisible et qui reste bientôt stationnaire et inaltérée pendant plusieurs mois, sans jamais devenir foncée, comme cela arrive dans la culture classique du bacille typhique.

6° Cultures en bouillon de viande. — Le bouillon simple de Lof fier n!est pas un des meilleurs milieux nutritifs pour le microbe de la fièvre jaune, surtout quand il est récemment isolé du cadavre, ou provient d'une vieille culture sur gélose. Dans les deux cas, les cultures sont toujours peu abondantes et monirent, même après 24 heures, des formes d'involution, représentéespar des renflements terminant en forme de massues. C'est ce qui se passe aussi, comme on sait, avec le vibrion cholérique.

Lorsque le bac. ictéroïde s'est définitivement habitué à vivre sur des milieux nutritifs artificiels, la culture en bouillon s'obtient régulièrement et elle se traduit par un aspect trouble, bien appréciable, sans pellicules ni dépôts floconneux. Elle ne se fait pas bien au-dessous de 14°-16° C.

Les microbes se multiplient dès le début sous une forme régulière et un peu plus longue que sur gélose; mais, après 5 ou G jours, ils commencent à présenter des formes d'involution. Les cellules s'allongent, s'enflent aux pôles, présentent des nodosités, des fragmentations, des dégénérations vacuolaires, etc., jusqu'à ce que, vers le 8" jour, on n'y trouve plus que des figures bizarres, absolument méconnaissables.

Annales de l Institut Pasteur

i>L. XI

BACILLUS ICTEROÏDES

BACILLUS COLI CÛMMUNIS