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Isolement des ferments. — Pour isoler les ferments du miel, différentes méthodes peuvent être employées.

C’est ainsi que l'or pourrait produire dans le miel mis en solution un précipité de phosphate de chaux, qui en se précipitant entraînerait par un véritable collage les diastases présentes [méthode Cohnheim\. Mais étant donné la faible quantité de ferments dans le produit examiné, nous n'avons pas obtenu d'aussi bons résultats qu'avec la méthode suivante basée sur la précipitation des ferments par l'alcool ;

On dissout le miel dans le moins d’eau possible (quelques centimètres cubes), en s’aidant au besoin de la douce température d’un bain-marie. On verse ensuite goutte à goutte le miel ainsi fluidifié dans dix fois son poids d’alcool absolu. On précipite ainsi les ferments, les matières albuminoïdes et un peu de sucre. On centrifuge el on décante ensuite le liquide clair surnageant {le précipité adhérant généralement aux parois du vase). On reprend par 10 cc. d’eau distllée et la solution trouble obtenue est filtrée, pour séparer les matières albuminoïdes insolubles dans l’eau, le pollen. .., etc. On rince finalement le filire avec un peu d’eau distillée, On a ainsi une solution limpide de ferment,

Propriétés des ferments obtenus. — Si on réduit la solution aqueuse de ferments jusqu’à un volume de quelques centimètres cubes, qu'on reprécipite ces ferments en versant la solution concentrée dans 100 ce. d'alcool absolu, on obtient un précipité, présentant les caractères d'une poudre blanche, sans forme cristalline quand on l’examine au microscope. Si on décante à

nouveau l'alcool et si on reprend par quelques centimètres cubes d’eau le précipité adhérant aux parois du tube à centrifuger, on constate qu'il se dissout immédiatement.

Nous avons ensuite recherché à quels ferments nous avions à faire.

a) RECHERCHE DE L’AMYLASE. — Nous avons ajouté à 100 cc. d’une solution de ferment (provenant de 10 gr. de miel), 1 ce. d’empois d’amidon à 1°/, (1). Nous avons prélevé 1 cc. du mélange pour y verser une goutte de solution 10do-1odurée (2); nous avons eu une solution bleue tenant en suspension de fines granulations de grains d'amidon gonflés. Nous avons alors mis la solution à étudier dans une étuve réglée à 50-60°. Après cinq minutes, en répétant l'essai précédent avec la liqueur d’iode, nous avons encore obtenu une coloration bleue, mais une disparition des grains d’amidon. Enfin, en répélant ces essais, toutes les cinq minutes, il s’est formé toute une série de teintes : violet, lie de vin, rose, acajou, et finalement jaune pâle, indice de la disparition d'amidon.

Il se produit dans ces diverses réactions une saccharification plus ou moins complexe de l’amidon, saccha-

(4) PRÉPARATION DE L’EMPOIS D'AMIDON. — On mesure 100 cc. d’eau distillée ; on en prélève quelques centimètres cubes pour délayer 1 gr. de fécule de pomme de terre. On porte le reste de l’eau à l'ébullition et on y fait tomber la suspension d’amidon en agitant constamment. On laisse refroidir et on compiète à 100 cc.

(2) PRÉPARATION DE LA LIQUEUR D'I0DE. — On triture dans un mortier de verre 0 gr. 5 de KI et 1 gr. d'l, avec quelques centimètres cubes d’eau distillée. On ajoute ensuite peu à peu 70 cc. d’eau environ. On verse la solution dans un vase jaugé à 400 ce. et on complète à 100 cc. avec l’eau de lavage du mortier.

MOREAU. k

rification qui a fait l’objet de nombreuses théories que nous n'avons pas à fare rentrer dans le présent travail.

Disons toutefois que d’après Lintner (1) et pour l’amylase du malt, il se forme cinq corps : trois dextrines :

Amylodextrine, érythrodextrine, achrodextrine, et deux sucres : isomaltose et mallose.

b) RECHERCHE DE L'INVERTINE. — Nous avons opéré de même en remplaçant l’empois par une solution de saccharose à 0,50 pour 10 cc. et en mettant à l'étuve à 30°. En faisant un Utrage au Fehling avant la mise en marche et un second après un abandon de plusieurs jours, on constate que la quantité de sucres réducteurs a augmenté ; il s'est formé en effet du sucre interverti.

Conditions favorables d'activité des diastases. — L'intensité des réactions diastasiques que nous venons de voir est très fortement influencée par les conditions physiques et chimiques de l'expérience ; ces conditions d'activité, varient en effet avec la température, la réaction du milieu, l'oxygène, la lumière. Enfin, à côté de ces influences d'ordre physique et chimique, elles varient avec le {emps et les quantilés de diastases mises en œuvre.

Influence de la température sur l’amylase. — En faisant agir pendant un même temps de l'amylase de miel sur de l’empois d’amidon, à des températures comprises entre Ü et 100°, il se produit des variations importantes dans la réaction.

On trouve, en effet, deux périodes principales : une

(1) LinrNer, D. Chemg., 26, 2533.

première pendant laquelle l’action diastasique, de très faible qu’elle était à de très basses températures, va en croissant de plus en plus rapidement, pour atteindre un maximum : c’est la température optimum. Une seconde période à partir de cette lempérature oplimum où il ya par contre décroissance de l’activité diaslasique jusqu’à une température particulière, où le ferment est détruit et où l’action s'arrête : c’est la température mortelle.

La température oplimum n’a pas été très facile à déterminer; toutefois, après quelques tâlonnements, nous avons remarqué que en opérant {toujours dans les mêmes conditions, la température la plus favorable à l’activité de la diastase varie entre 40 et 50° et la température mortelle autour de 85°

Influence de la réaction du milieu sur l’activité de l’amylase. — Kjeldhal (1} avait remarqué que « si l’on ajoute de faibles quantités d’acide à une solution de saccharose additionnée d’invertine, l’inversion se trouve activée ; si l’on en ajoute davantage, on obient bierttôt une proportion pour laquelle l’action de l’invertine est. ralentie ; pour une proportion plus forte, l’action est de nouveau augmentée. Mais ce dernier effet doit être rapporté à l'acide qui intervertit par lui-même le sucre de canne, alors que les deux premiers sont le résultat de l'influence d’abord activante, puis affaiblissante qu'ils exercent sur l’invertine.

O. Sullivan, Thompson, étudièrent de l'acide sulfurique, en présence de l’inverune.

(1) KRiecona, Nogle Jagttagelser over invértin [Merd. fra Carisbory-Laborat, 1, 1881, p. 331.

HR

Fernbach, celle de l’acide oxalique, lartrique suCCInique, lactique, acétique.

MM. Maquenne et Roux (1), recherchèrent « la grandeur que doit avoir l'acidité où l’alcalinité du mélange, pour que la vitesse de saccharification, dans l’action de l’'amylase sur l’empois d'amidon y atleigne sa valeur maxima. » Ils arrivèrent ainsi à faire en moins d’une heure des saccharifications qui auraient exigé plusieurs Jours.

En présence des faibles quantités de ferments contenus dans le miel, 1l était de première importance de surexciter en quelque sorte leur activité; la solution des ferments du miel étant légèrement acide, pour opérer

toujours dans les mêmes conditions, nous avons neutralisé ÿ

h au moyen de NaOH =, et après de nombreux essais

10° comparatifs, nous avons {rouvé qu'il faut ajouter 1 ce. 5 d’une solution titrée d'acide formique à 1 °/, pour être dans les conditions oplimum d’acidité.

Action de l'oxygène et de la lumière. — Parmi les influences d'ordre chimique agissant sur les diastases, il y a lieu de signaler l’action de l'oxygène à laquelle les diastases sont sensibles : « Il y a affaiblissement, elles semblent apparaître comme des corps oxydables dont l'oxydation a pour effet d’atténuer où même de détruire le pouvoir diastasique (2).

Enfin, la lumière produit comme l’oxygène un phéno-

(1) Maouenxe et Roux, C. R. 4. $., t. CXLII, p. 124. (2 Wouontz, Dict., Supp. art. Diaslases, p. 60.

mène néfaste sur l’activité des diastases et en particuher des diastases en solution.

Aussi, si l’on ne veut pas leur voir subir rapidement une perte notable d’aclivité, on aura avantage à opérer avec des fioles aussi remplies que possibles, bien bouchées, en verre jaune ou enveloppées de papier.

Action du temps. — Si l’on fait agir une diastase à la température optima, on constate que la quantité de matère transformée est proportionnelle au temps, ou si l'on fait varier la quantité de diastase, on constate qu’au bout du même temps, la quantité de malière transformée est proportionnelle à la quantité de diastase. »

C'est ce qu'on exprime dans une formule unique : « les quantités de diastases nécessaires pour transformer une même quantité de malière sont inversement proporhionnelles aux temps pendant lesquels elles agissent. »

On pourra donc doser, sinon la quantité des diastases du miel, mais du moins comparer la richesse diastasique de ces produits sucrés, en dosant la quantité de matière transformée {saccharose amidon), en opérant toujours dans les mêmes conditions de temps.

Application des notions précédentes à l'analyse biologique.

Ces considérations générales étant faites, pour rechercher :

1° Si un miel contient de l’amylase et de l'invertine ;

2° En quelles proportions.

On procédera de la façon suivante :

1° Recnercue De L'aMyLAse. — Cet essai qualitatif

D ir ee

peut se faire directement sur le miel mis en solution ou sur le ferment isolé.

a) Directement sur le miel. — On dissout 10 gr. de miel dans 10 ce. d’eau distillée ; on divise la solution après filtration en deux parties égales dont l’une est portée à l’ébullition et servira de témoin. Chacun des deux liquides est mis dans un tube à essai et additionné de 1 ce. d’empois d'amidon à 1°/, et de 1 ce. 5 d'une solution d'acide formique à 1 °/, après neutralisation de

N ve la solution du miel au moyen de NaOH -— On agite et

on abandonne à 45°, pendant un temps variable (de 15 minutes à une demi-heure). On prélève dans chacun des deux tubes, des quantités aliquotes qu'on examine avec la solution 1odo-iodurée en notant les teintes obtenues.

B) Sur le ferment isolé. — On précipite le ferment selon la méthode donnée {p. 48); on le met en solution dans 20 cc. d’eau disullée, on divise la liqueur en deux parties égales et on conlinue comme précédemment.

On opérant ainsi, les teintes oblenues avec l'iode sont beaucoup plus nettes. \

2° DosaGE DE L'AMYLASE. -— On pourrait croire que le polarimètre peut donner des renseignements rapides, car les dextrines possèdent un pouvoir rotatoire très élevé, beaucoup plus fort que celui du maltose : en conséquence, en supposant que les dextrines aient toutes le même pouvoir rotaloire, 1l suflirait semble-t-il de précipiter les dextrines par l'alcool, les reprendre par l’eau et de faire un examen polarimétrique. Comme tous les miels renferment ces dextrines (Voir lableaux, p. #1

el suiv.), un dosage préalable de ces dernières donnerait

par différence la quantité de dextrines produites par l’effet de la diastase. Mais péquement on ne peut avoir recours à cette méthode.

Il est nécessaire que la liquéfaction de l’empois soit complète pour faire l'examen polarimétrique ; en attendant plus longtemps, on aura sans doute un liquide clair, mais à ce moment, la saccharification est très avancée et on n'obtient que des déviations polarimétriques difficilement mesurables. |

Le procédé de choix sera celui fondé sur le dosage des sucres réducteurs formés :

Dans nos analyses, nous avons opéré sur les ferments isolés de 20 gr. de miel ; nous avons divisé la solution de ferments en deux parties égales dans deux vases jaugés À et B de 100 ce. (B porté à l’ébulliion sert de témoin). Nous avons ajouté après neutralisation 1 ce. 5 de solution d'acide formique à 1 °/,, 50 ec. d’un empois correspondant à 0 gr. 25 de fécule de pomme de terre et complété à 100 cc. avec de l'eau distillée bouillie et refroidie. La précipitation alcoolique entraînant toujours un peu de matière sucrée, nous avons, avant la mise en marche, fait un dosage à la liqueur de Fehling, en prélevant 5 cc. de solution étendue à 25 ce. avec de l’eau distillée.

D'autre part, afin d'arrêter le développement des microorganismes, nous avons ajouté V goultes de toluène, nons avons bouché fortement les fioles, nous les avons enveloppées de papier pour éviter l’action de la lumière et nous avons abandonné le tout 24 heures dans une étuve réglée à 45°-50°.

Après 24 heures, nous avons dosé les sucres réducteurs formés par un nouveau ütrage au Fehling.

RS Me

La différence des résultats nous a indiqué la quantité de sucres réducteurs formés.

En rapportant les résultats à 100 gr. de miel et en tenant compte des dilutions, les analyses ainsi conduites nous ont donné les résultats exprimés en grammes de sucres réducteurs formés dans le tableau de la page 60.

RECHERCHE ET DOSAGE DE L'INVERTINE. — (Comme pour l’amylase, on pourra faire l'essai soit directement sur le miel, soit en isolant le ferment.

La présence de l'invertine étant manifestée par l’inversion du saccharose, il faudra nécessairement, pour se rendre compte de la réaction, faire un dosage du sucre interverti ; de sorte que l'essai qualitatif devient un essai quantitatif.

x) Dosage par isolement de l'invertine. — Nous avons opéré comme pour le dosage de l’amylase, en remplaçant l’empois d'amidon par 5 cc. d'une solution de saccharose à 10 °/, et en abandonnant quatre jours dans une étuve réglée à 25°-30° (Voir résultats p. 60).

B) Dosage directement sur le miel. — On pourrait opérer directement sur le miel, mais les résultats sont beaucoup moins sensibles qu'en pratiquant comme précédemment : on dissout 20 gr. de miel dans 100 cc. d’eau environ, on filtre et on complète à 200 ce. avec de l’eau distillée après avoir neutralisé et ajouté 3 ce. de la solution d'acide formique à 1 °/, et 1 gr. de saccharose préalablement dissous dans un peu d’eau. On divise la solution en deux parties égales dans deux fioles A et B jaugées de 100-110 ce. On dose ensuite les sucres réducteurs de la fiole A. Pour cela, on ajoute V gouttes de S. Ac. de Pb., on complète à 110 cc. et on mélange. On

= dt =

ajoute ensuite Ô gr. 50 de charbon, on agite et on filtre. On prélève enfin 10 cc. du liquide filtré incolore que l’on étend à 100 cc. et on examine au Fehling, en se servant de 10 cc. de liqueur titrée. On a ainsi les sucres réducteurs avant la mise en marche.

D'autre part, on met la fiole B, additionnée de V gouttes de toluène dans une étuve réglée à 25-30° pendant quaire jours et pour titrer les sucres réducteurs formés après ce temps, on refait la même opération que précédemment.

La différence entre les sucres réducteurs du flacon B et du flacon A représente la quantité de sucre interverti formé.

Recherche des oxydases. — La présence des ferments (amylase-invertine) étant constatée, 1l était permis de se demander, si à côté de ces enzymes, il n'y avait pas, comme dans le lait, produit aussi naturel que le miel, des éléments capables de provoquer l'oxydation de corps facilement oxydables : paraphénylène-diamine, gaïacol, hydroquinone, etc., en présence ou non d’eau oxygénée ; en un mot s'il n’y avait pas des anaéroxydases ou des aéroxydases.

Marpmann (1) se basant sur la réaction de Storch, veut distinguer les miels centrifugés des miels chauffés et d’après ses observations, les premiers doivent avoir un effet positif, tandis que les derniers ont un effet négalif, par la réaction à la paraphenyléne-diamine : 1l ajoute à 10 cc. d'une solution de miel (1-2), X gouttes d’une solution à 1 °/, de paraphénylène-diamine, secoue, verse

(4) MarpmanN, Pharm. Zlq., 1903, 48, 1001.

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ensuite quelques gouttes d’eau oxygénée à 3°/, et agite : le miel centrifugé se colore en bleu gris, puis en violet indigo, le miel chauffé ne se colore pas ».

Nous avons refait ces expériences sur des miels français non chauffés et chauffés :

Dans les deux cas, nous avons obtenu après quelques minutes une coloration grenal el non violette comme avec les oxydases du lait cru par exemple.

Nous avons alors essavé de caractériser les aérox ydases et les anaéroxydases avec la teinture de gayac, la benzidine.., etc.

Avec la teinture de gaïac. — Nous avons pris 10 cc. de miel mis en solution (1-2) et nous avons divisé la solution dans deux tubes à essai :

Dans l’un, nous avons ajouté { ce. de teinture de gayac fraîchement préparée ;

Dans l’autre, 1 ce. de la même teinture et une goutte d’eau oxygénée à 1 °/.

Même après 24 heures, dans les deux cas, nous n'avons obtenu de coloration bleu verdâtre.

En opérant dans les mêmes conditions avec le gaïacol, l’'hydroquinone, l'acétate de benzidine, lé réactif de Meyer, etc., nous avons eu le même insuccès.

Nous croyons donc pouvoir pouvoir conclure à l’absence d'aéroxydases et d’anaéroxydases.

Catalase. — Cependant, en ajoutant directement l’eau oxygénée dans la solution du miel (1-2) et en mélangeant, nous avons remarqué après quelques minutes un dégagement plus ou moins abondant de bulles d'oxygène. Il est vraisemblable de croire que les corps qui ne provoquent pas l'oxydation de la paraphénylène diamine, de

SO

la benzidine..., etc., en présence de l'eau oxygénée et qui donnent cependant lieu, en présence de ce réactif, à un dégagement d'oxygène inactif, comme l’appelle M. Sarthou (1), sont des catalases.

DosAaGE DE L'OXYGÈNE DÉGAGÉ. — Le dégagement de l'oxygène de la catalase est généralement apprécié, en dosant l’eau oxygénée non décomposée au moyen dune solution de permanganate de potasse (3 gr. 16 pr. 1000) en présence de 1 ce. d'acide sulfurique, d’après la formule :

5 H20 + 2 MnO:K + 3 SO: H2 — 2 SO: Mn + SO:K? 28 HO +5 O:.

Mais étant donné la quantité des sucres réducteurs du miel, la teinte rose de la fin, due à l'excès de permanganate de potasse n'est pas stable, aussi, nous avons préféré doser directement le volume d'oxygène dégagé.

Mode opératoire. — On dissout 5 gr. de miel dans 10 cc. d’eau distillée, bouillie et refroidie, on opère de même avec un Lémoin porté à l’ébullition et on filtre sur un coton serré. Chacune de ces solutions est versée dans une éprouvette à gaz et additionnée de 10 ec. d’eau oxygénée à 12 vol., au dixième, neutre et à la tempéralure du laboratoire.

On agite doucement et on porte sur une cuve à mercure. Après 24 heures, on fait la lecture.

Nous avons appliqué les méthodes biologiques décrites précédemment à l'analyse d'un certain nombre de miels dont les résultats sont exposés dans le tableau suivant (2).

(4) M. SarrHou, J. Ph. et Ch., 6° série, t. XXX, p. 350.

(2) Les numéros de la première colonne correspondent aux numéros des miels des tableaux page 40 et 41, où nous donnons les résultats micrographiques, saccharimétriques, chimiques.

INVERTINE | AMYLASE en S. R. 0. |S. R. ch

N° |cALCULÉ en 1 8.55 3 8.99 k 9.53 és) 11.17 6 11.22 7 11.60 8 12.02 9 12.61

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