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compare la couleur bleue ainsi obtenue avec une solution étalon de phosphate à laquelle on a ajouté les mêmes réactifs. (Nous avons remarqué que si on chauffe le tube après l'addition de réactif sulfomolybdique jusque vers 60 ou 70 degrés, on pouvait ajouter sans attendre le chlorure stanneux, la couleur bleue apparaît alors immédiatement, et son intensité n’est altérée ni en plus ni en moins.)

CHAPCTRE "TI

La comparaison des deux méthodes — américaine et céruléomolyhdique — fait ressortir certaines analogies et

certaines Gppositions qu’il nous a paru intéressant de souligner. |

1° Bell et Doisy diluent le sérum assez fortement : une partie de sérum pour 4 parties d’eau et d’acide trichloracétique, ou une partie de sang dans 10 parties d’eau et d'acide.

Denigès emploie parties égales de sérum et d'acide.

2° Le réactif molybdique employé dans les deux méthcdes est sensiblement le même pour la teneur en molybdate, mais beaucoup plus acide dans le procédé Denigès.

3° Le réducteur employé est l’hydroquinone pour la: méthode américaine et le chlorure stanneux pour la méthode française.

4° Bell et Doisy ajoutent à la fin de l'opération une solution de carbonate sulfile destinée à intensifier la couleur bleue obtenue et à éliminer la nuance verdâtre due à la présence de la quinone.

Rien d’analogue dans le procédé Denigès.

Nous avons essayé de rechercher l'influence sur le résultat finai de ces différentes façons de procéder et pour cela nous avons effectué plusieurs séries d’expériences.

A) Influence de l'acidité du filtrat. — On dispose une série de onze petits tubes à essai dans chacun desquels on

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verse 1 cc. d’une solution de phosphate, contenant 1 milligramme de P?205 pour 200 centimètres cubes. On ajoute à partir de la gauche de l’eau distillée : un centimètre cube dans le premier tube, neuf dixièmes de ce. dans le second, huit dixièmes dans le troisième et ainsi de suite, en diminuant de un dixième par tube jusqu’au dernier, dans lequel on ne met pas d’eau.

Ensuite on verse de l’acide trichloracétique à 20 %. Dans le premier tube, où l’on a versé un centimètre cube d’eau, on ne met pas d’acide. Dans le second, on met un dixième de centimètre cube, dans le troisième on en met deux dixièmes et ainsi en suivant jusqu’au dernier tube qui reçoit un centimètre cube d’acide. :

Nous avons done une série de tubes renfermant chacun la même quantité de phosphate, et des proportions croissantes d'acide trichloracétique, le tout ramené au même volume,

Puis on pratique la réaction céruléomélybdique: D’abord on compte dans chaque tube 2 gouttes de réactif molybdique de Denigès, puis une goutte de chlorure stanneux. On voit alors s'établir dans la série des tubes une gamme colorée de bleu, variant du bleu intense dans le tube n° 1 jusqu’à un bleu presque incolore et teinté de vert dans le dernier.

Si alors on établit dans cette série de tubes des épaisseurs différentes de liquide pour obtenir par transparence des éclairements égaux, on trouve que les épaisseurs sont régulièrement croissantes du premier tube jusqu’au dernier et que celui-ci est de vingt à quarante fois plus considérable que le premier. (Cette proportion très variable de 20 à 40 tient à la petite quantité de liquide à examiner et à la difficulté qui en résulte au point de vue colorimétrie).

On voit donc le rôle considérable que joue l’acide dans l'intensité terminale de la réaction. L'idée de neutraliser cet acide conduit immédiatement à effectuer une autre série d'expériences, dans laquelle on dispose dans une

PE Ce

autre série de tubes la même quantité de phosphate, la même quantité d’acide et des. proportions croissantes d’un alcalin quelconque. Nous avons répété cette expérience de nombreuses fois en faisant varier chaque fois un seul des facteurs : quantité de phosphate — quantité d’acide — quantité d’alcalin de différentes sortes (soude ou sulfite de soude) et le résultat était toujours identique dans ses variations : augmentation de l'intensité de la couleur bleue jusqu’à un certain taux d’acidité. Si l’acidité diminue trop, la réaction colorée ne se produit plus.

Dans ces dernières expériences, on remarque une certaine irrégularité dans l’accroissement de l'intensité de la couleur bleue, due au fait qu’il faut mesurer deux fois une très petite quantité — moins d’un centimètre cube de liquide — et que des erreurs de un centième de centicube répétées deux fois produisent des variations d’intensité notables.

B) Influence du réducteur. — L’hydroquinone donne une nuance verdâtre qu’il est nécessaire de faire dispa- ‘aître pour l'exactitude de la lecture : c’est le rôle dévolu au sulfite. C’est encore une possibilité de faire des erreurs de dosage, peu sensibles, il est vrai, pour le résultat final.

Le chlorure stanneux donne un bleu pur. Il est nécessaire cependant de lemployer en quantité très petite. La plupart du temps. une goutte, ou une demi-goutte ou même moins, est suffisante.

Si on voit apparaître une nuance jaune, c’est que la quantité de chlorure est trop forte on que la quantité de phosphate est trop faible.

Il nous à paru d’autre part que le bleu obtenu par le chlorure stanneux était plus intense que celui dû à l’hydroquinone, C’est pourquoi il est inutile d’ajouter du carbonate pour augmenter l’intensité.

C) Influence de la dilution. — Nous avons étudié par-

ticulièrement l'influence de la dilution et nous avons procédé à un grand nombre d’expériences portant, soit sur le sang total, soit sur le sérum et les globules et le résultat nous a amené à penser que c'était à la dilution qu’il fallait attribuer les différences considérables que l’on observe dans les diverses évaluations du taux du phosphate inorganique.

Après nous être procuré une certaine quantité de sérum, nous l’avons réparti par dose de 1 ec. dans une série de tubes. Puis, nous avons ajouté de l’eau distillée en quantité croissante. Dans le premier tube, il n’y avait que du sérum, dans le second, il y avait deux dixièmes de centimètre cube d’eau, dans le troisième, quatre dixièmes, et ainsi de suite jusqu’au dernier en augmentant de deux dixièmes de centimètre cube par tube la quantité d’eau ajoutée.

Au bout d’un certain temps, variant de 10 minutes à 48 heures, nous avons procédé au dosage par une des méthodes colorimétriques après avoir précipité les albumines par l'acide trichloracétique.

Les résultats ont toujours été constants dans leurs variations :

En donnant à la quantité de phosphate inorganique dosée dans le premier tube la valeur 1, nous trouvons dans les autres tubes les valeurs suivantes (ces chiffres sont des moyennes de vingt observations et sont obtenues en comparant les hauteurs différentes des liquides donnant des éclairements égaux) :

Tube n° 2 contenant 2 dixièmes de cc. d’eau. 1:25 — 3 4 " = = 118 — À — 6 ne = 2.40 — 5 ue 8 + = 2 3.0 — 6 — ACC U CAN EN MAT : 4,75

Pour des dilutions plus fortes, les chiffres obtenus pré-

pr ee

sentent de trop grands écarts pour pouvoir établir des moyennes. Pour une dilution de 5 fois son volume d’eau, un sérum nous a donné 10 fois la valeur observée sans dilution, tandis qu’un autre 2 fois seulement.

Si on opère sur du sang total ou sur des globules, la variation du taux des phosphates inorganiques est encore plus importante.

Pour résumer la comparaison des deux méthodes colorimétriques, nous.voyons qu’il v a en faveur de la méthode céruléomolyhdique de Denigès :

a) Une plus grande simplicité dans les opérations;

b) Un réducteur plus comnrode;

c) Et surtout une moins grande dilution.

Ces différents avantages conduisent à une plus grande exactitude dans les résultats et nous nous étonnons que la plupart des auteurs tant français qu’étrangers, qui s’occupent de dosage de phosphore méconnaissent cette méthode et emploient surtout celle de Doisy et Bell.

CHAPIFRE, HI

Nous avons vu le rôle considérable que peut avoir l’addition de très petites quantités d’eau au sérum, dans l'augmentation des phosphates inorganiques. Mais d’auires facteurs encore peuvent influer sur les chiffres trouvés.

À ce point de vue, le temps joue un rôle important et, suivant que la recherche des phosphates inorganiques suit de quelques minutes la prise de sang, ou, au contraire, est reportée plusieurs heures après, pendant lesquelles le caillot est en contact avec le sérum, les chiffres sont très différents.

On trouve après 48 heures des valeurs 5 à 6 fois supérieures à celles trouvées une demi-heure après le prélévement de sang.

Les radiations chimiques influent également et pour un échantillon de sérum exposé pendant 5 heures au soleil, la quantité de phosphate inorganique trouvée a été nettement supérieure à celle d’un autre échantillon du même sérum resté dans l'obscurité pendant le même temps.

Les chiffres trouvés étaient dans le rapport de 1 à 1.25.

Une remarque s'impose, qui a été faite par Zucker et Gutman (Reprinted from the Procedings of the Society for experim. Biology. and Med), c’est que la détermination du phosphate inorganique du sang est douteuse à cause de la facilité avec laquelle le phosphate organique soluble est hydrolisé et ces auteurs arrivent à émettre l’hypothèse suivante :

«Les Ions phosphates sont en réserve dans le globule

RoBERT à