CARACTÈRES CULTURAUX SUR LES DIFFÉRENTS MILIEUX

Solution de peptone.

Bouillon simple.

Bouillon peptoné.

Sur ces milieux les caractères des cultures sont presque identiques. Nous envisageons chaquefois des cultures effectuées :

1) à + 37° dans un milieu de pH = 7,6 2) à + 220 DHL) » » A) 6}. À Hu SEC 7 LAURE SES » » AN à 4) à + 220 DE) » » 10,4

Tous les milieux ont toujours été ensemencés à l’aide de prélèvements bactériens d’une culture sur milieu synthétique F. âgée de 15 jours et effectués au moyen de la pipette de PASTEUR graduée et stérile, de sorte que pour tous les milieux il y avait au début présence d’hormogones favorisant le départ des cultures et évitant ainsi un facteur d’erreur dans l'interprétation des observations macroscopiques.

Dans les milieux soumis aux conditions signalées au 1° nous avons constaté l’apparition d’un voile léger dès les premières 48 heures. Après trois jours celui-ci devient plus marqué et il apparaît un léger trouble uniforme dans le milieu. Les tubes s’éclaircissent cependant très vite en abondonnant un dépôt d’un blanc neigeux. Le voile se déchire bientôt, un anneau se fixe aux parois du tube, et prend une coloration blanc-grisâtre. Dès le sixième jour la culture ne semble plus se développer et l’évolution semble arrêtée.

Le voile est forme d'éléments bacillaires assez longs; le dépôt est constitué d’agglomérations de formes coccobacillaires.

Dans les milieux soumis aux conditions du 2° f’aspect de la culture est à peu près pareil, mais le troublé dans le milieu n'apparaît que vers le cinquième ou sixième jour et la poussée devient beaucoup plus luxuriante. Le voile reste très longtemps à la surface du liquide. Le dépôt est beaucoup moins abondant. Mais le développement s’arrête de même très tôt et les propriétés nutritives de la peptone semblent très limitées.

Ceci pouvait être constaté :

Dans les milieux soumis aux conditions 3° et 4°, nous avons eu des résultats tout à fait identiques; une croissance assez limitée, formant d’abord un voile fragile, plus où moins fugace, un trouble léger et uniforme du milieu tout d’abord, puis la formation d’un dépôt, plus riche dans les milieux aux pH = 6,4 que dans ceux de pH = 7,6.

Jamais il ne se forme ni bulles de gaz, ni pigments diffusés. Exceptionnellement, sur une solution de peptone CHAPOTEAUT placée à + 220 et ajustée au moyen de l’acide chlorhydrique à un pH — 6,4, ensemencé, comme d’ordinaire, avec une souche pure, en prenant toutes les précautions d’asepsie, nous avons vu apparaître une coloration vert jaunâtre. La culture, après s’être troublée dès les premiers jours, et formé un dépôt abondant blanchâtre, montra après 12 jours d’ensemencement une très faible teinte jaune pâle, qui dans la suite s’accentua et devint vers le dix-huitième jour de culture nettement vert jaunâtre.

Nous avons examiné microscopiquement cette culture et nous avons pu nous assurer qu'aucune contamination par accident ne s'était produite.

La peptone à elle seule paraît donc suffire au Bacillus Citrulli SARTORYI comme source d’azote et de carbone, mais c’est évidemment un aliment très médiocre, qui ne paraît jouer qu’un rôle tout à fait accidentel, et très exceptionnel, dans la fonction chromogène de notre organisme.

1) Bouillon de viande glycériné.

La culture en bouillon de viande glycériné présente les mêmes caractères que sur bouillon simple, mais la récolte sur les milieux répondant aux quatre conditions indiquées antérieurement est, comparativement au bouillon simple, sensiblement plus abondante. La glycérine semble donc être

attaquée par l’organisme, auquel elle peut servir d’aliment hydrocarboné. Ce trialcool a aussi une influence sur la fonction chromogène du bacille. Ceci devient apparent sur les milieux placés à + 220.

Sur le bouillon de viande glycériné de pH = 6,4 et cultivé à + 220 if se forme une pellicule fragile, dont les bords adhèrent fortement aux parois du tube où du ballon. La partie moyenne se déchire très vite et il se forme dès le troisième jour un trouble dans le milieu de culture avec un dépôt gris au fond du tube. Puis le liquide devient de nouveau limpide; à ce moment, vers le sixième jour, nous voyons une faible diffusion, d’une teinte rose très pâle qui commence à la partie supérieure du milieu et se propage lentement en profondeur. Mais l’évolution cesse bientôt et la couleur du bouillon limpide reste constamment d’un rose atténué.

Le bouillon glycériné placé à + 220 et de pH — 7,6 donne un voile un peu plus résistant à la surface du liquide, et dès le troisième jour, nous voyons ici l’apparition d’une teinte vert jaunâtre, très peu prononcée au commencement. Cette coloration s’accentue très peu dans la suite, mais quelquefois vers le huitième ou le dixième jour ia couleur verdâtre commence, surtout vers les zones supérieures, à faire place à un ton rose, qui cependant disparaît par la suite dans la troisième semaine et la coloration verte persiste alors continuellement.

Pour étudier les causes de ce phénomène nous avons dans une série de tubes, contrôlé les variations de la concentration en ions H pendant l’évolution du bacille. Nous nous sommes alors rendu compte que dans les milieux à pH — 6,4 dès le huitième ou dixième jour de culture, le milieu a atteint une acidification telle que le pH est monté à environ 5. Ceci peut être dû tout d’abord à une dégradation de la glycérine, donnant naissance à des acides organiques, mais nous croyons que l’action du bacille sur le trialcool est très vite épuisée et qu’alors celui-ci continue à transformer les albuminoïdes. À ce moment il doit déjà se produire un arrêt des multiplications microbiennes; les ferments protéolytiques continuant leur œuvre amènent alors le milieu à une acidité terminale située dans ces expériences à pH — 4,15. C’est donc seulement sous-l’influence de cette acidité que se produit le virage du chromogène vers la teinte rose.

Mais de toute façon, si le Bacillus Citrulli SARTORYI est capable d’attaquer la glycérine, il ne profite que très peu de cet aliment. Ce caractère semble rapprocher notre Bactérie du groupe du Bacillus mucosus capsulatus, proche parent lui aussi du pneumobacille de KRIEDLÆNDER isolé par FASCHING, des malades grippés en 1890, et dont une des propriétés biochimiques différentielles avec ce dernier est justement l’attaque légère de la glycérine.

2) Bouillons sucrés.

L’addition aux solutions de peptone ou aux bouillons de 3% de monosaccharides tels que glucose, galactose, lévulose, ou de 5 %, de disaccharides tels que saccharose, maltose, lactose, ou mannite a une influence très favorable sur le développement du bacille, aussi bien à + 37° qu’à + 229; entre tous les sucres c’est cependant le glucose qui favorise le plus la croissance de notre organisme; le saccharose et le mallose sont presque aussi favorables. La bactérie donne sur tous ces milieux une pellicule épaisse, très compacte et homogène.

Il reste toujours en voile à la surface et rarement au bout de quatre à six semaines de culture celui-ci se déchire pour tomber en grands flocons en profondeur. On peut néanmoins constater une différence entre les cultures sur milieux de pH initial de 6,4 et de pH — 7,6 placés à + 220. Les premiers milieux se troublent très tôt, puis il se forme un dépôt abondant d’une coloration blanche au fond du tube. Ensuite le milieu s’éclaircit et on voit dès le deuxième ou troisième jour l’apparition d’une teinte rose claire dans le substratum. Au bout de 15 jours de culture cette teinte devient nettement rouge brique et les éléments bactériens restent toujours d’un blanc sale. Sur les milieux de pH — 7,6 le développement est un peu plus rapide au commencement, mais Île culot est toujours moins abondant et {a pigmentation rose fait toujours défaut, étant remplacée par une coloration vert jaunâtre, qui quelquefois vire un peu au rose: mais ce caméléonage est toujours très fugace et la teinte verdâtre reste dominante. En contrôlant de plus près ce phénomène nous avons pu constater que la bactérie en milieu glucosé à pH — 7,6 fait augmenter dans la première semaine de

culture la concentration en ions H jusqu’à un pH de 5,03; mais à ce moment il y a un arrêt dans l’acidification et la courbe de réaction remonte vers l’alcalinité, pour rester fixe au bout de 12 à 14 jours, époque où la réaction terminale est de pH — 8,35 environ. Dans ce cas, en présence d’un hydrate de carbone facilement assimilable et au pH initial de 7,6 la bactérie semble d’abord attaquer les sucres, produisant une acidification notable, puis cette attaque s’arrête; tandis que les matières azotées continuent à être transformées et par leur décomposition la réaction redevient définitivement alcaline. II semble donc que l’attaque de la matière quaternaire est différente dans les deux cas soit que nous partions d’un pH initial de 6,4 ou d’un pH initial de 7,6.

Ceci semble surtout être attribué à l’involution de la bactérie et la forme en bâtonnet doit produire des ferments protéolytiques beaucoup plus actifs que la forme coccobacillaire, qui pousse dès le commencement du développement dans les milieux sucrés légèrement acides au début de la culture. 6

Jamais nous n’avons pu constater de dégagement gazeux sur les milieux des deux catégories.

Nous faisons dès à présent remarquer que la pigmentation rose apparaît dans nos milieux acides sucrés; qu’il y a cependant dans nos milieux alcalins sucrés cultivés à + 220 l’apparition constante d’un chromogène verdâtre, qui peut artificiellement, par acidification avec l’acide acétique ou chlorhydrique, être changé en rose ou rouge.

Nous aurons l’occasion de revenir sur ce phénomène.

3) Solution de peptone gélosée

Sur plaques de gélose ordinaire à pH — 6,4 ou pH — 7,6 peptonisée à 2 % et exposées à + 229, on obtient le quatrième ou cinquième jour après l’ensemencement, une colonie de la taille et de {a forme d’une lentille à surface unie, brillante et d’une couleur blanc grisâtre par réflexion et verdâtre par transparence.

Les jours suivants la colonie augmente très lentement; elle péut perdre sa forme ronde et devenir échancrée ou

festonnée. Plus tard la colonie prend un aspect visqueux blanchâtre, beaucoup plus blanc à la périphérie de la colonie qu’au centre.

Sur tube de gélose inclinée en strie, il n’y a encore le lendemain de la culture qu’un piqueté léger le long du trait d’ensemencement. Ces colonies confluent vers le troisième ou quatrième jour; vers le sixième jour on a une bande visqueuse à bords lisses, réguliers ou dentés, d’un blanc luisant.

La culture sur bouillon peptoné gelosé est assez semblable à la précédente. Le développement est lent et il apparaît rarement dans le milieu à pH initial de 6,4 une faible diffusion d’une teinte rose très pâle; ordinairement la gélose se colore en jaune sale.

Sur gélose simple sans addition, substrat n’ayant pas subi l’action de l’ammoniaque et de l’acide chlorhydrique, Je bacille ne se multiplie pas; une simple addition d’asparagine à l’agar ordinaire ne suffit pas pour améliorer le milieu; mais une addition d’asparagine et de glucose ou de fécule de pomme de terre, donne suivant la réaction un rose vineux, ou un vert bleuâtre, avec un développement très abondant de la bactérie. La fécule favorise surtout l’apparition de la teinte bleue; le glucose celle de la teinte verdâtre dans les milieux alcalins.

Sur bouillon de viande sucré gelosé le développement est très intense. On voit toujours se former très vite un tapis épais à la surface de la gélose, qui devient rapidement visqueuse et d’un gris sale. Mais dès le troisième jour de la culture la pigmentation apparaît dans les couches sousjacentes à pellicule bactérienne. La diffusion se fait assez lentement, et il faut souvent 4 à 5 semaines à + 220 pour que Îa coloration fmprègne uniformément le milieu gélosé: mais les éléments bacillaires gardent toujours leur couieur gris sale non définie. Suivant les matières hydrocarbonées employées et la réaction initiale du milieu, on observe des teintes bleuâtres, verdâtres, rouges, violettes: à une température culturale de + 329 ou + 370 Ia matière chromogène tait défaut. Sur milieu gélosé ensemencé en piqûre, il ne se forme pas de bulles de gaz. Microscopiquement le tapis à la surface des milieux solides est presque uniformément constitué par des formes coccobacillaires (fig. VII). :

4) Milieux végétaux.

Sur milieu de pomme de terre, la bactérie forme un enduit épais, visqueux, avec une couleur blanc sale. L'évolution est assez bonne, mais l’apparition d’une coloration fait toujours défaut.

Sur milieu de carottes, l’aspect macroscopique de la culture est identique que sur le milieu précédent.

Sur tranche de melon ou de banane stérilisée dans des tubes de Roux l’évolution de la culture est beaucoup plus rapide.

Dès le troisième jour on constate l’apparition d’une teinte rosâtre sur la tranche du fruit, limitant les colonies bactériennes. Plus tard le liquide se colore uniformément en rose violacé dans la profondeur du tube.

5) Milieux synthétiques.

Ayant ainsi constaté, comme nous venons de le décrire que :

19 La Bacillus Citrulli SARTORYI se développe aussi facilement sur milieu liquide que sur milieu solide;

29 que ses propriétés morphologiques sont beaucoup plus marquées et spécifiques sur les milieux liquides;

3° que la fonction chromogène est beaucoup plus prononcée, que la diffusion du pigment s’effectue plus facilement, et que l’apparition de cette propriété n’est pas du tout liée à une exposition en grande surface sur des substrats d’une certaine consistance, tel qu’on peut le constater souvent pour d’autres bactéries chromogènes, nous avons pensé que nous pouvions effectuer une étude bien plus précise et plus facile, en employant pour les recherches biochimiques et l’analyse de la matière coiorante, des cultures sur un milieu de composition fixe.

Les raisons énoncées ci-dessus nous ont décidé à employer des milieux liquides, et nous avons déjà donné la formule du milieu synthétique, qui nous a fourni les résultats les meilleurs.

Sur ce milieu à base d’asparagine et de glucose nous avons obtenu des résultats de luxuriance et de vitesse de culture, qui étaient en tous points au moins égaux à ceux obtenus sur milieu au bouillon de viande sucré (fig. IV).

A la température de “+ 370 les cultures évoluaient toujours très vite, sous forme d’une pellicule très dense à la surface du substratum et donnant surtout dans Île milieu à pH initial de 6,4 un dépôt très abondant. Nous avions toujours remarqué l’absence de bulles de gaz et d’un pigment chromogène. Les cultures placées à + 229 par contre, ont toujours donné naissance à une matière chromogène, qui dans l’un des cas était verdâtre, dans l’autre rose ou rouge; le pigment verdâtre a toujours viré au rose où au rouge par addition d’une quantité suffisante pour une légère acidité, d’un acide minéral ou de l’acide acétique.

À l’examen microscopique des cultures évoluées sur ces milieux nous avons toujours constaté les caractères fixes et spécifiques de la bactérie déjà décrite dans le chapitre consacré à la morphologie du Bacillus Caitrulli SARTORYI.

C’est donc ce milieu synthétique qui nous a servi pour l’étude des caractères biochimiques, et pour les recherches concernant la matière colorante.