CHAPITRE IV PROPRIÉTÉS BIOCHIMIQUES

Afin :

19 d'établir les milieux les plus simples et les mieux définis, pouvant servir d’aliments à notre bactérie;

2° de mettre en évidence les rapports qui existent entre la constitution chimique d’une substance et sa valeur nutritive;

3° de parvenir à expliquer la formation du pigment par le microbe en suivant la série des transformations chimiques d’un certain nombre de substances définies, permettant ainsi des conclusions sur la nature et la constitution de ce pigment, nous avons été amené tout d’abord à faire les

expériences suivantes :

1) Action du Bacille sur les matières azotées et hydrocarbonées.

A) Cultures sur milieux minéraux, renfermant comme source d’azote un sel ammoniacal minéral.

B) Cultures sur milieux renfermant comme source d’azote un acide aminé, un amide, un sel ammoniacal d’acide organique.

C) Cultures sur milieux en présence d’alcools polyatomiques ou de sucres.

D) Cultures sur milieux renfermant des sels ammoniacaux minéraux et des substances hydrocarbonées.

E) Cultures sur milieux renfermant des substances quaternaires organiques et des sucres.

Le milieu de base pour ces expériences a toujours été le suivant :

Phosphate bipotassique .... LO gr.

Sulfate de magnésie ........ 0,5 »

Chlorure de sodium......... 0,5 »

Pnmdistilléer ah aude Lu, : : 260007 rec:

A ce milieu nous avons ajouté au fur et à mesure pour chaque cas à étudier {a substance minérale ou organique, dont nous avons voulu constater l'influence sur le microbe et sur son métabolisme.

Dans chaque tube de culture nous avons introduit chaque fois 10 gouttes de la solution du produit à examiner. La recherche de l’ammoniaque, qui a pu se former au cours de l’assimilation des substances azotées, a été faite pour chaque cas de la façon suivante :

La culture en ballon renfermant 200 ce. de milieu est distillée en présence d’une trace de magnésie calcinée. Le distillat est recueilli dans un tube contenant quelques gouttes d’acide sulfurique à 10 %,. Le liquide ainsi obtenu a été chaque fois divisé en deux parties : dans la première nous avons caractérisé l’'ammoniaque par le réactif de NESSLER; dans la seconde nous avons ajouté Ir ce. d’une solution d’iodure de potassium à 10 %, et quelques gouttes d’eau de Javel; en présence d’ammoniaque il se forme un piécipité noir.

Pour la caractérisation de l’acide carbonique, nous avons effectué des cultures dans des tubes de BORREL reliés à l’appareil de BARCROFFT. Les observations ont duré chaque fois 48 heures. Pour éviter des erreurs provenant de la présence de l’oxygène, nous avons intercalé entre le tube de culture et l’appareil de BARCROFFT, un flacon barboteur renfermant du pyrogallate de potassium. À la fin de l’opération toute trace d’acide carbonique présent dans le milieu a été chassée en ajoutant de l’acide sulfurique à 10 %, à raison de 5 cc.

En outre nous avons employé pour l’étude biochimique de notre Bactérie la méthode du #wbe B. indiquée par BESSON, RANQUE et SENEZ, qui est d’un emploi très simple et très pratique.

Ce procédé est basé sur l’action réductrice du microorganisme sur le rouge neutre, et les variations notables de cette propriété suivant la constitution du milieu de culture. Les sucres ajoutés en petites quantités à un milieu, favorisent la réduction; si on augmente progressivement cette quantité de sucre, l’action favorisante disparaît d’abord, puis fait place à une action contraire. pu: 1 LÉ

MRLUre : : e L’expérience est faite de Ia façon suivante avec le milieu de culture ci-dessous :

Eau de viande de bœuf .

mL 1.000 cc Glucosetasthit ebartidebanets et 4 gr.

Solution aqueuse de rouge neutre

Gris tee rase s MGR TERRA À ÉEc

On répartit dans des tubes à essais assez larges et contenant un tube à hémolyse renversé qui sert de cloche à fermentation. Après stérilisation on ensemence et on place la culture pendant 48 heures à l’étuve à + 220. On peut alors apprécier :

a) les phénomènes de réduction du rouge neutre;

b) Les phénomènes d’acidification et d’alcalinisation du milieu ; c) La production ou la non-production de gaz avec

le glucose, et l’approximation de la quantité de gaz produite.

Les germes qui, sans réduire, acidifient, font virer la couleur à une teinte amarante; l’alcalinisation produit au contraire une teinte rose saumon ou porto.

La réduction se traduit pai une fluorescence.

On peut donc avec cette technique, classer le germe ensemencé dans le groupe des réducteurs, ou des non-réducteurs, dans le groupe des germes inertes vis-à-vis des sucres, ou des germes attaquant les sucres avec gaz ou sans gaz.

Pour notre bactérie nous avons eu dans cette expérience les résultats suivants :

Teinte amarante (après 48 heures, plus tard masquée par l’apparition du pigment propre à la bactérie, et devenant un peu plus claire).

Pas de gaz.

Le Bacillus Citrulli Sarloryi est donc un non-réducteur, acidifiant le milieu par l’attaque du glucose, sans production de gaz, et se rapproche par ces caractères du Bacille Typhique.

Ces caractères ont été contrôlés à nouveau par le procédé de GRIMBERT et LEGROS au moyen du milieu suivant :

Glucose ue 205.3 Hoi ps D. Rrgr es] Pebionent US hEMOS:. sut. AISNE Latidistiléerssmrds vas. ailes 100 cc.

CarbonaterdehcalGiunrmsemr. eus 2 Ia

Teinture de Tournesol ...:..... q. S.

Dans ce milieu la culture de la bactérie fait virer la couleur au rouge et cette teinte se maintient alors constamment; d'autre part, les acides produits par la fermentation du sucre mettent en liberté l’anhydride carbonique, et lon constate dans le tube à hémolyse une forte production de bulles gazeuses, soulevant le tube.

A) Cultures sur milieux minéraux renfermant comme source d'azote un sel ammoniacal minéral.

Nous avons déjà indiqué dans un chapitre précédent un milieu à base de succinate d’ammoniaque, utilisé précédemment par nous et contenant aussi du glucose. Le mulieu renfermant 2,5 gr. de succinate d’ammoniaque a permis à notre bactérie un développement, faible cependant, et à un pH de 6,4 nous avons remarqué l’apparition d’une coloration rougeâtre dans les milieux.

Les titres de solution de sels ammoniacaux ont été pour ces raisons fixés à une teneur identique à celui du milieu initial de succinate d’ammoniaque, c’est-à-dire que 10 gouttes avaient une teneur en ammoniaque équivalente à 0,011.

Chlor- Carbonate Azotate Nature du sel N H: biais d'NH:

PÉMERE PR RE T RTSA à 96 53,5 80 (DÉHCUESENEN EE Eee 34 17 17 Quantité de sel corres-

pondant à 0,011 d’'NH° 0,031 0,0346 0,0518 Titre de la solution ... 0/57% ON, T0 Résultat de développe-

ÉHENTNR: PE ANRON. AM Néant Néant Néant Pismenteunse. tn arokh.t Néant Néant Néant

B) Cultures sur milieu renfermant comme source d’azote un acide aminé, un sel ammoniacal d’acide organique, ou un amide.

Les conditions d’utilisation de ces sels étant les mêmes que les précédentes, nous reproduisons pour chacun d’eux les quantités calculées pour obtenir des solutions de titre ammoniacal toujours identique. Quant aux acides aminés ils ont été incorporés au milieu minéral à un titre tel que la

teneur en azote correspond exactement à celle qui est contenue dans 10 gouttes de solution de succinate d’ammoniaque à 1/10, donc à 0,0092.

Nature du sel FRE Pres Guanidine |Asparagine| Glycocolle | Tyrosine ERNST ER ne 152 12 122 122 I81I Teneur en NH + ue 42 38 —— IGHMEUNE Ne 14 14 Quantité de sel cor-

respondant à

0,011 d'NH ...| 0,0491 | 0,0401 | 0,0265 | 0,0433 — — Quantité de sel cor-

respondant à

00002 AN er — | 0,0492 | o0,1189 Titre de la solu-

tion. Al 1/10 | 0,8/10 | o0,53/10| 0,85/10| 1,10 | 2,35/10 Résultat de déve- ÿ é 5 À | ds

Ces résultats sont donc strictement négatifs. Le développement de la bactérie est impossible sur un milieu renfermant des produits azotés minéraux d’un côté et de l’autre côté en présence des produits organiques renfermant à la fois de l’azote et du carbone. Nous voyons donc que le pouvoir protéolytique de notre champignon doit être restreint.

C) Cultures sur milieux minéraux en présence d’alcools polyatomiques ou de sucres.

Les milieux out été préparés en ajoutant à notre milieu de base 10 gouttes par tube de solution à 10 % des diverses substances hydrocarbonées :

Substances Sd GRIS ; de développement de pigmentation Glycérine ... Néant Néant Mannite .... ) »

Daleites.s.4 » »

Glucose 24.2 faible développement | Coloration rose faible Galactose ... » | »

Saccharose . Très faible Très faible | développement

Battossss faible développement »

Maltose ..... » »

Nous voyons donc que les alcools polyatomiques sont encore inaptes pour l'assimilation du Bacillus Citrulli ; par contre les faibles traces de substance quaternaire nutritives apportées par les produits d’ensemencement introduits dans les milieux à base de sucres, ont suffit pour amorcer la culture et la production d’un pigment rose. D’autre part nous voyons que la Bacillus Citrulli est capable d’assimiler les sucres : glucose, galactose, saccharose, mallose, lactose.

D) et E) Cultures sur milieux renfermant à la fois des sels ammoniacaux minéraux, où des substances azotées organiques et les substances hydrocarbonées.

Les sucres mis en expériences ont été : le glucose et le maltose, les alcools polyatomiques ont été : la g/ycérine et la dulcite. Les quantités de substances introduites et la technique ont toujours été les mêmes.

Dégagement de

trs. CO? dans la cul- : dans S :

Coloration ture après 4 Jours

ment la culture de sur

48 heures milieu milieu

initial |[carbonaté

Présence

Matière azotée Développe-

Glucose k Carbonate NH5 ..... faible verte présent Néant | 1 unité Azotate d'NHS » » » » (eo) »

Succinate d'NHÈ ..… » faible rosé néant » + 0% ASDATADIDENT pce très bon très forte » » 6 »

Glycocolle BAR" Mr. 7 assez bon | faible vert présent » 10 » PeDIOneR LEE re. très bon [vert ou rose néant » (ON

Maltose Carbonate NH3 ..... très faible | faible vert présent néant | o unité AZotatewN HE"... » » » » [e] »

SuCCmate NES... faible » » » ve »

ASDATAPINEMERT re rer bon forte rose néant » Ohms Glycocolle here. assez bon verte » » 8 »

BeDione ne rer très bon très forte » » TOM 0

verte ou rose

Glycérine Carbonate NH3 ..... néant néant néant néant | o unité AZotate NES tre. » » » » o »

Succinate NÉE ee très faible verte présent » ON ASparapIne Meet eue bon faible rose néant » AE Glÿcocolle#" "177 très faible | faible verte présent » Oo » BéDIODE RE -ree très bon faible rose néant » 6 »

Dulaite

Carbonate NH3 ..... néant néant néant néant | -o unité Azotate NH 2. Fe » » : » » OM Succinate NHS :..... » PANNE a » TASER ASpatanine eee. LE » dre ; » » CS Glycocolle RL » » » » [e] »

PEPtOnE Men rte faible faible rose | quelquefois » ES

ou verte présence

De ces expériences nous pouvons tirer les conclusions suivantes :

D’une manière générale les matières quaternaires organiques semblent de meilleurs aliments azotés que les sels ammoniacaux. En absence de produits ternaires, soit alcools polyatomiques, mais surtout des sucres, aucun produit chromogène n’a pu être démontré. La dulcite n’est pas attaquée par le bacille et ne paraît pas intervenir dans la production du piginent. La glycérine de même est à elle seule un aliment peu assimilable, elle ne joue aucun rôle dans lPapparition du pigment, car si on bloque dans le milieu à base d’asparagine-glycérine, la fonction amine par l’acide chlorhydrique, de sorte que seule la fonction amide reste disponible, on ne peut plus constater la formation de la coloration; dans l’expérience avec le glycocolle, la fonction amine semble aussi seule responsable de la production chromogène.

D'autre part les produits quaternaires employés seuls sans addition de substances ternaires, sont inaptes à fournir la matière chromogène. Il faut la présence d’un aliment ternaire, si impropre que soit cette matière à l’assimilation (comme la glycérine par exemple); sa présence est indispensable pour la production du chromogène. I1 se forme alors dans ce cas, une très faible production d’acide, puis cette réaction ne tarde pas à être neutralisée par les bases résultant de l’attaque des substances azotées, puis on note la présence de l’'NH3 libre dans la culture, donc pratiquement tout se passe comme si la matière quaternaire avait existé seule dans le milieu. Si le développement de la bactérie continue, il se produit une nouvelle acidification et le chromogène vire au rose. Ceci devient encore plus apparent dans les milieux à bases de glucose ou de maltose. Ici, en présence de tout produit azoté, soit minéral, soit organique, nous constatons la formation de la substance chromogène. Cette matière peut diffuser dans le milieu avec une teinte verte ou rose à + 220 à + 379, cependant le milieu semble invariablement incolore et clair, mais ceci n’est qu’apparent, car si on retire le milieu de 37° et que l’on ajoute une légère quantité d’acide jusqu’à faible acidité, la coloration rose apparaît, le chromogène existe donc toujours dans un milieu renfermant un sucre ou une autre substance ternaire assimilable, et répondant aux conditions nécessaires à sa formation. Le colorant

est aussi, comme nous le constatons dans ces expériences, en relation directe avec la réaction du milieu, car chaque fois que nous avons pu trouver la présence d’ammoniaque libre au deuxième jour de la culture, le chromogène apparut sous sa variante verte, tandis que, chaque fois que le développement et l’évolution du bacille a été très prononcé et que l’assimilation ternaire a pris le dessus sur l’assimilation azotée, l’acidification devenant très marquée et dominant pendant toute la durée de la culture, le chromogène diffuse dans le milieu avec une teinte rose ou rouge très constante. La formation du pigment dépend donc de la présence dans le milieu de substances ternaires et elle est d’autant plus marquée que cette matière est plus favorable au métabolisme du bacille, devenant la plus prononcée avec les hydrates de carbone. |

2) Recherches des propriétés protéolytiques.

a) Action sur le sérum coagulé.

Ensemencé sur tube de sérum coagulé, le Bacillus Citrullh pousse très vite; la culture est visqueuse, blancgrisâtre. L'aspect microscopique des prélèvements sur ce milieu nous montre la forme en bâtonnet. Le sérum n’est pas liquéfié et nous n’observons jamais la présence d’une substance chromogène

b) Action sur le blanc d'œuf

Dans des tubes de bouillon de viande de pH = 7,6 nous avons introduit des petits cubes de blanc d’œuf coagulé par la chaleur et stérilisé à l’autoclave. Le milieu a été ensemencé et placé à des températures culturales de + 220 et + 370. Le Bacillus Citrulli se développe très normalement, en voile blanc à la surface du milieu, formant ensuite un dépôt crémeux au fond du tube. Mais nous n’avons jamais pu constater la dissolution ou une attaque du blanc d’œuf par la bactérie.

c) Action sur la gélatine.

Sachant que généralement l’attaque de la gélatine est plus prononcée chez les bactéries par les enzymes protéolytiques, que vis-à-vis des autres matières protéolytiques,

et que la gélatine est ordinairement plus facilement dissoute que les albumines coagulées, nous avons ensemencé sur un milieu gélatine-peptone en piqûre et en surface sur tubes inclinés.

Par la première méthode nous avons obtenu une culture très caractéristique, avec formation d’une petite ampoule au tiers supérieur. Plus tard il se forme un tapis d’un blanc brillant à la surface de ce milieu. Dans celui-ci apparaît vers le quatrième jour de la culture autour de la tache due à l’ensemencement par piqûre, une coloration rose ou verte suivant les conditions de.culture et cette coloration diffuse par suite lentement à travers tout le milieu; car la diffusion du pigment est aussi intense dans le fond du sillon de la piqûre qu’en surface.

Sur la gélatine peptonée en tube incliné, nous avons observé la formation d’un tapis blanc crémeux et l’apparition de la pigmentation naissant au niveau de contact de la culture avec le substratum et diffusant plus tard à travers tout le milieu. Mais la gélatine n’est jamais liquéfiée par l’action de 1a bactérie.

3) Recherche de l'hydrogène sulfuré.

Un grand nombre de microbes produisent de l’hydrogène sulfuré aux dépens des albuminoïdes, caractère de différenciation très important pour le diagnostic des bactéries. Nous avons préparé des tubes renfermant 5 cc. de gélose. Après stérilisation et liquéfaction de la gélose, nous avons introduit dans chaque tube une goutte d’une solution d’acétate neutre de plomb à 10 % préalablement stérilisée. On mélange avec soin et on refroidit sous le robinet d’eau. Ce milieu est ensemencé avec le Bacillus Citrulli en piqûres profondes. Le culot gélosé est resté invariablement blancgrisâtre, et le bacille ne noircit pas le plomb; la production de l’hydrogène sulfuré fait par conséquent défaut.

4) Recherche de l’Indol.

Le bacille a été ensemencé sur une solution de peptone CHAPOTEAUT à 5%. Après cinq jours de culture nous avons ajouté un centimètre cube de solution de nitrite de potassium à 19/00 et 8 gouttes d’acide sulfurique pur et concentré. On porte la partie supérieure du tube à l’ébullition, il apparaît

alors une coloration rose très nette. Quand la réaction est terminée, on introduit 2 ce. d’alcool amylique et on agite avec précaution. On laisse reposer pour que la séparation des deux liquides s’effectue et on constate une coloration rose très marquée de la couche alcoolique.

Il y a done production d’indol.

Mais dans la suite de nos expériences nous avons remarqué que la présence de notre substance chromogène sécrétée par le bacille aurait pu intervenir dans cette réaction et nous induire en erreur. Pour cette raison nous avons plus tard refait cette expérience de la façon suivante :

Distillation du milieu de culture après acidification légère par l’acide chlorhydrique; alcalinisation légère du distillat par la soude et redistillation. Dans ce liquide bidistiflé nous avons encore pu caractériser la présence de l’indol par la méthode précédente.

5) Recherche des nitrates.

Un milieu de :

PeptonegChapoteaut ptet 10 gt.

Chlontértdelsoumens 2 SD Nitrate Ne POtASSIUNU AE T0 ACER PO EURNE. PO RAR r.O00ice

a été ensemencé et cultivé à + 37° pendant 5 jours. Si on ajoute ensuite lentement à la culture 2 ce. d’acide chlorhydrique pur, on voit apparaître une teinte rose, qui s’accentue pendant plusieurs heures. La Bacillus Citrulli produit donc sur le milieu précédent des nitrites, car la réaction indolnitreuse, (réaction du rouge de Choléra), est positive.

6) Action sur le lait

Nous avons contrôlé l’action du bacille sur le lait en le cultivant sur lait tournesolé à + 220 où + 370.

Dès le deuxième jour nous avons constaté que la teinte vire franchement au rouge; il y avait donc fermentation du lactose, et par suite production abondante d’acide. La caséine est précipitée par la formation de l’acide lactique. Au bout de 8 à 10 jours le coagulum formé commence à disparaître et le lait devient limpide, prenant une coloration jaune rougâtre.

Sur milieu de lait seul nous observons la précipitation de la caséine, formation d’un pigment rose, qui, par la suite, devient par la dissolution de la caséine, jaune sale.

Le Bacillus Citrulli ne semble donc pas produire un ferment lab, il attaque lactose et sécrète une caséase.

7) Action sur les sucres.

Nous avons déjà vu au commencement de ce chapitre que le Bacillus Citrulli assimile les sucres suivants : glucose, galactose, saccharose, maltose, lactose.

Afin de vérifier ces constatations et d’examiner l’action de ia bactérie sur d’autres substances ternaires, nous avons eu recours au procédé de GRIMBERT et LEGROS déjà mentionné antérieurement, dans les recherches du pouvoir réducteur et d’acidification de notre bacille. Nous avons donc employé un bouillon carbonaté tournesolé auquel nous avons ajouté au fur et à mesure les matières ternaires à examiner.

Nous avons ainsi constaté que le Bacillus Citrulli SAR- TORYI, en présence de peptone comme substance quaternaire, attaque rapidement le glucose, le lévulose, le maltose, le saccharose et Îa mannite. La teinte rouge du tournesol apparaît déjà dans ces milieux de la seizième à Îa vingtquatrième heure, et le tube à hémolyse se remplit d’acide carbonique mis en liberté par le carbonate de calcium. L/attaque du lactose et de la glycérine est plus faible et plus lente et ne débute souvent qu’au cours du deuxième ou troisième jour. La dulcite, elle, n’est pas attaquée, et ne peut servir d’aliment à la bactérie. Tous ces sucres sont assimilés avec une production très remarquable d’acide dans le milieu, mais le dégagement de gaz par l’action directe de l’organisme sur les sucres est toujours négatif; par conséquent le Bacillus Citrull rentre dans la catégorie de microbes attaquant Îes sucres, mais sans dégagement de gaz.

8) Action vis-à-vis de la cellulose.

Dans le chapitre où nous avons exposé l’origine de notre souche bactérienne, nous avons déjà dit, que la bactérie ne peut pas être l’agent primaire de la maladie des Cucurbilacées, puisqu'elle n’attaque pas les couches cellulosiques de la membrane de ces fruits.

Pour ces raisons nous avons repris les expériences de A. SarroRv, R. Sarrory et J. MEYER (125). En plaçant des cultures de Bacillus Citrulli directement à la surface de melons ou de bananes nous n'avons jamais pu reproduire de lésions de ces fruits. Si par contre nous prenons la précaution de léser artificiellement la membrane du fruit, ou si nous piquons avec l’ensemenceur chargé du produit bactérien dans la profondeur du tissu végétal, les caractères de la maladie n’ont jamais tardé à apparaître dès le troisième jour après l’inoculation.

D'autre part, sur des coupes microscopiques effectuées avec des morceaux de fruits infectés, nous n’avons pas pu observer l’intrusion de la bactérie à travers les cuticules cellulaires, et la présence de germes à l’intérieur même des cellules végétales. Par contre, les amas bactériens se trouvent toujours dans les tissus intersticiels du fruit, écartant même les cellules de place en place.

Nous avons de plus essayé d'isoler, si possible, un ferment cellulolytique éventuel. Pour cela nous avons cultivé la bactérie sur des coupes de melon pendant 4 semaines dans des boîtes de PÉTRI. Puis nous avons ajouté à ce milieu 5 cc. de toluène, substance bactéricide, mais sans action sur les ferments. Puis nous avons exprimé dans un mortier le substratum et le tout a été filtré. Le filtrat a été mis en présence de cellulose pure à + 37°. Aucune action sur la cellulose n’a pu être observée. Le bacille cultivé dans les conditions les plus favorables en aérobie et anaérobie et renfermant comme matière ternaire de la cellulose pure râpée, n’a pas évolué. Par conséquent nous nous croyons en droit de conclure que le Bacillus Citrulli ne produit pas de ferment cellulolytique et qu’il est incapable d’assimiler la cellulose.

9) Recherche sur la différence du métabolisme assimilateur du Bacillus Citrulli Sartoryi en culture incolore et en culture colorée.

Nous avons pu constater que la bactérie se développe sur certains milieux dans des conditions définies, soit sans produire de matière chromogène, soit avec l’apparition d’une teinte verdâtre ou diffusion dans le milieu, d’un pigment rose ou rouge très important.

Monsieur le Professeur SARTORY nous a posé le problème suivant : Essayer d'examiner s’il y avait une relation entre la formation chromogène et le métabolisme vital de la bactérie : rechercher si l’absence de la production du pigment pouvait être considérée comme une diminution de la vitalité et du pouvoir assimilateur du bacille où si tout le phénomène du pouvoir chromogène se passait sans influence aucune sur les autres caractères du bacille. Pour résoudre cette question, nous avons eu recours à des recherches quantitatives concernant l’assimilation et les propriétés dégradatrices du bacille vis-à-vis de Ia peptone comme matière azotée et vis-à-vis du glucose et du saccharose comme substance hydrocarbonée. Nous avons préparé notre milieu minéral :

Phosbhate, bipotassique LrEn Hs rR 1,0 gt.

uHate dékmapnésie ne Ant CE LE tr tÉ ch 0,5 » Crbenate dééoidé not. Jr 25m rés 0,5 »

EE ST TE RE PE TP PP 000 Ce:

À ce milieu nous avons ajouté soit de la peptone seule, à raison de 2 grammes pour 100 gr. de milieu, soit de la peptone plus glucose à 3%. Toutes les cultures ont été effectuées à la température de + 370. La solution de peptone a été ramenée au pH — 7,6. Le milieu glucosé a été ajusté une première fois au pH — 7,6 et une seconde fois au pH — 6,4. Nous avons ainsi obtenu une culture sans chromogène, une autre avec un pigment vert, et une troisième avec une coloration rouge.

Pour évaluer l’activité du pouvoir assimilateur vis-à-vis de Îa peptone nous avons eu recours à la mesure volumétrique de la quantité d’acides aminés formés en employant la méthode de formoltitration de SGRENSEN (126).

Mode opératoire :

100 cc. de milieu à examiner renfermant 2 gr. de peptone sont mis avec de la soude N/10 en présence de phtaléine de phénol comme indicateur. La quantité de soude employée pour faire virer les indicateurs représente les acides libres. Après le virage on ajoute 10 cc. de formol exactement neutralisé au préalable.

La mise en évidence de la fonction acide des acides aminés, par le bloquage de la fonction amine se produit, et la nouvelle quantité de soude N/10 nécessaire au virage donne les acides aminés totaux.

Nous avons mis en contact 5 récipients de culture contenant 100 grs. de milieu avec du ferment trypsique de POULENC: ces ballons ont été placés à la température de + 370 à un pH de 7,6 pendant 15 jours. Après cette période la dégradation de la peptone en acides aminés était complète.

Nous avons d’abord dosé les acides libres préexistants dans le milieu de culture vierge à 2% de peptone, puis par la méthode de SôRENSEN, nous avons obtenu la quantité des acides aminés totaux résultant de la dégradation de la peptone. Enfin nous avons dosé les milieux ensemencés avec notre bactérie pendant 15 jours, de la même façon, c’est-à-dire en neutralisant d’abord le milieu pour déterminer ensuite les acides aminés formés par l’action du bacille.

À une troisième série de cultures nous avons alors ajouté 10 cc. de toluène, afin de supprimer l’action de la bactérie, et au milieu ainsi stérilisé nous avons encore incorporé du ferment trypsique de POULENC. Le tout est placé à + 370 et on a fait appel encore une fois à la méthode de formol-titration. Les dosages ont été effectués sur 5 ballons et les chiffres indiqués sont la moyenne des résultats obtenus. Les dosages ont été pratiqués le premier, troisième, sixième, neuvième et quatorzième jour après l’ensemencement.

Les tableaux suivants expriment les résultats trouvés pour 100 cc. de milieu en centimètres cubes de soude décinormale.

Milieu pepione glucose à pH : 6,4

———————————————""—“ûû mûr

Acides Acides aminés

Te Acides aminés | Acides aminés ours | Acide libre aminés : n é 6 J par l’action on dégradés | employcs par

totaux au BAIE par le bacille le bacille

Milieu peptone glucose à pH — 7,6 ee cm OS DIE 13-19

Acides aminés

Acides - : , | Acides aminés | Acides aminés Jours | Acide libre aminés ee non dégradés | employés par totaux AutiscieclP2S le bacille le bacille ee nl CORNE D 97 pr re me oalqndes I o) 30 0 30 0 3 5,3 30 12 17,1 0,9 6 0,7 30 22,6 2,6 4,8 9 0,8 30 24,7 O 5,3 14 0 30 24,6 0 5,4 Milieu peptone à pH — 7,6 I o) 30 o) 30 o) 3 0,2 30 730 21,8 0,4 6 ( 30 18,9 9,5 1,6 9 0 30 27,4 0 2,6 14 O 30 272 O 2,8

De ces expériences nous pouvons conclure tout d’abord en considérant les acides libres dans les substrats, que dans le milieu peptone-glucose à réaction acide initiale, cette acidité augmente très vite pour rester, après 6 jours de culture, à peu près constante. Dans les deux autres milieux la courbe de réaction augmente aussi dans les 3 premiers jours de culture vers l’acidité. Mais ensuite, par l’attaque de la matière quaternaire, l’alcalinité s’effectue de nouveau très vite dans le milieu et par conséquent le ferment trypsique peut agir d’une façon très prononcée. Ceci devient en effet très apparent dans la 3° colonne de nos tableaux; tandis que dans le milieu initialement acide en présence du sucre, la dégradation de {a peptone est très lente et progresse par faibles étapes, nous remarquons que dans les milieux alcalins, le pouvoir protéolytique a dégradé dès le 6€ jour de la culture la presque

totalité de la peptone.

Quant à l’assimilation même de la bactérie nous pouvons dire que l’apparition du pigment rose ne favorise en rien l’assimilation de matière azotée; au contraire celle-ci est plus prononcée dans le milieu peptone-glucose à pH = 7,6, donc

dans le milieu, où il y a production dela substance chromogène, celle-ci existant à l’état incolore, donc ne pouvant pas intervenir dans le métabolisme assimilateur. Sur milieu de peptone seul, par conséquent en l’absence de substances ternaires spécifiques, le développement de la bactérie est assez bon, et l'assimilation protéique n’est guère moins prononcée que dans le milieu, où la production du colorant atteint son maximum.

Quant à la recherche de la fonction assimilatrice vis-à-vis des hydrates de carbone, nous avons employé notre milieu synthétique F. auquel on a ajouté soit 3% de glucose, soit 5% de saccharose. La concentration en ions H des milieux a été fixée pour les uns à pH — 6,4, pour les autres à pH — 7,6. Les milieux ont été stérilisés par une tyndallisation pratiquée pendant 8 jours à une température de + 90° et durant une heure par jour. De plus nous avons suivi cette technique pour les deux milieux à un pH — 7,2 et au moment de l’emploi seulement nous avons ajusté la concentration en ions H au titre voulu, en ajoutant aseptiquement au fur et à mesure soit de l’acide chlorhydrique N/20, soit de la soude N /20.

Ces deux solutions ont été stérilisées au préalable. Aïnsi nous avions toutes les garanties de travailler dans des conditions rigoureuses et exactes.

De plus, des milieux témoins non ensemencés ont été préparés et exposés pour chaque expérience aux mêmes conditions que les milieux ensemencés. Ils nous ont servis, premièrement de contrôle de l’asepsie de nos manipulations et secondement à titre de rectificatif en cas de décomposition ou d’interversion des sucres. Les dosages ont été effectués au moyen de la méthode de BERTRAND après défécation des milieux avec la solution de DENIGÉS. Les tableaux suivants expriment les résultats obtenus après des cultures de 7, 15, et 21 jours.

Dosage après 7 jours de culture.

mr mm ù

Concen- | RENE Milieux |tration en ,/° °"aHon se Sucre 4) Puere Remarque ions I | de la culture | initial utilisé disparu q en pe un 20 nn ge dE Glucosé 6,4 rose pâle 3 gis. re 1,74 » CC 7,6 jaune 3 2,IT 0,89 Saccharosé 6,4 rose pâle 5 3,4 1,6 |non hydrolysé interverti spontaném.

Saccharosé 6,4 rose pâle 5 3,42 1,58 hydrolysé » 7,6 blanc 5 3,98 1,02 [non hydrolysé 5 interverti par le bacille » 7.6 blanc Es 4,18 0,82 hydroiysé Dosage après 15 jours de Culture Glucosé ..… 6,4 rouge e 0,9 2,1 » Sr TA jaune 3 22 0,8 Saccharosé 6,4 rouge vineux 5 1,88 3,12 [non hydrolysé interverti spontaném.

» 6,4 rouge vineux 5 1,88 are hydrolysé » 7,6 blanc crèm. 5 21 2,3 [nonhydrolysé interverti spontaném.

» 7,6 blanc crèm. 5 3,14 1,86 hydrolysé Dosage après 21 jours de Culture Glucosé ... 6,4 rouge violet 3 0,77 2,23 » So 7,6 ljaune verdâtr.| 3 1,39 1,61 Saccharosé 6,4 rouge vineux| 5 17 3,3 [non hydrolysé interverti spontaném.

» 6,4 [rouge vineux| 5 1,73 27 hydrolysé » 7,6 ljauneverdâtr.| 5 3,02 1,98 [non hydrolysé » 7,6 » 5 SAS 1,85 hydrolysé

De ces expériences nous nous croyons en droit de conclure, que dans les milieux glucosés et saccharosés de pH — 6,4 c’est-à-dire en présence du pigment rouge, le Bacillus Citrulli SARTORYI assimile la quantité la plus élevée en hydrate de carbone.

Ceci n’est nullement étonnant, car nous avons déjà pu démontrer dans l'étude des caractères morphologiques, que le bacille évolue vers une forme coccobacillaire, avec une prédisposition très prononcée à former un dépôt abondant dans la profondeur des tubes et à évoluer presque dans les conditions d’un anaérobie. Nous constatons en outre la présence d’une «invertase» dégradant le saccharose, mais malgré cette propriété l’assimilation de ce sucre est beaucoup moins importante que celle du glucose.

Un phénomène à remarquer est de plus l'arrêt presque complet de l’assimilation dans la culture âgée de plus de 15 jours.