PROPRIÉTÉS PHYSIQUES ET CHIMIQUES

a) Conditions physiques.

Toutes Îles recherches ont été faites en cultivant notre bactérie sur Île milieu synthétique F.

Nous avons déjà vu que l’apparition du pigment, comme celle des toxines bactériennes, dépend très rigoureusement de la réaction du milieu; c’est ainsi qu’à une réaction légèrement alcaline la coloration prend une nuance verte ou jaune, à une réaction légèrement acide nous voyons se former la nuance rouge; si le milieu acide vieillit la teinte se modifie encore vers un ton violet.

Dans une série de milieux nous avons fait varier la concentration en ions H de façon que le pH initial soit successivement de 2,54 3,38 4,24 5,63 6,24 7,68 IO,21; nous avons pu constater que la diffusion de Îa teinte rose était limitée entre les pH initiaux de 4,24 et 6,24. Au-dessus d'un pH —6,24 jusqu'au pH = 7,68 nous remarquons, suivant les matières ternaires introduites dans les milieux, des colorations jaunes, jaune-verdâtre, ou vertes. Au-dessous du pH — 4,24 et au-dessus du pH = 10,21 nous n’avons pu mettre en évidence la présence d’une substance chromogène. D’autre part, l’apparition de la propriété chromogène est fonction de la température culturale. Les milieux se colorent à la température ordinaire comprise entre + 10° et + 200: ils se colorent encore à des températures basses, mais le phénomène est peu marqué et inconstant. Les températures optima pour la production des pigments sont situées entre + 200 et + 270. La température limite optima est de + 329, Au-dessus de cette température aucune matière chromogène n’a pu être mise en évidence.

Afin de rechercher l'influence de la [lumière sur la production de la matière colorante, nous avons classé une série

de tubes au bord d’une fenêtre placée vers l’est, de sorte qu’ils ont été exposés à une lumière solaire assez intense; d’autres tubes ont été disposés dans une lumière diffuse à l’intérieur d’un laboratoire, et un troisième lot de cultures a été hermétiquement enveloppé à l’aide de papier noir épais et placé à l’obscurité complète.

Le colorant s’est formé dans les trois sortes de cultures et en tenant compte de {a différence de développement et de la richesse de la culture (le maximum de récolte a été obtenu en lumière diffuse, le minimum en lumière intense) la fonction chromogène est analogue pour les trois sortes de cultures. Par conséquent la lumière n’influe pas sur la production du phénomène de pigmentation.

Influence de l’oxygène sur la fonction chromogène.

Nous avons déjà constaté que la bactérie est une anaérobie facultative. Nous nous sommes demandés si l’oxygène pouvait intervenir dans l’apparition ou Île caméléonage du colorant. Nous avons pensé au phénomène de recoloration à l’air de la culture du Bacillus pyocyaneus et ses variétés, ou encore aux sucs de certains champignons qui prennent à lair une coloration bleue, rouge, violette, verte, rouge ou noire.

En effet les chromogènes bleus du Boletus cyanescens Buzz. et du Boletus luridus SCHAEFF. verdissent presque instantanément à l'air; ceux du Boletus pachypus et du Boletus calopus verdissent lentement; ceux du Psalliota campestris et du Lactarius fuligionosus FR. rougissent; ceux du ZLactarius uvidus KR. et du Lactarius flavidus Boup. deviennent violets; ceux du Psalliota flavescens Ros. et du Lactarius scrobiculatus SCor. deviennent jaunes; ceux du Psalliota Bernardii QUEL. brunissent et ceux du Russula migricans BUIL. deviennent noirs d’après les travaux de BOURQUELOT et G. BERTRAND.

À cet effet nous avons tout d’abord soumis des milieux incolores au jaune-verdâtre à une agitation vive à l’air, mais le résultat de recoloration est resté entièrement négatif. Les autres milieux ont été introduits dans des flacons barboteurs

et nous y avons fait passer un courant d’oxygène pendant plusieurs heures; cette expérience n’a pas donné non plus le résultat attendu. Nous avons alors eu recours à des cultures en anaérobioses stricte, pour constater si dans des milieux privés d'oxygène la fonction chromogène se manifestait encore. Nous avons employé des tubes à vide de Roux dans lesquels nous avons pratiqué au moyen de la trompe à eau un vide correspondant à 70 millimètres de mercure; d'autre part, nous avons cultivé la bactérie dans des tubes doubles d’après la méthode de BUCHNER en présence de pyrogallate de potassium. Dans ces deux expériences la bactérie s’est développée et les colorants rouges ou verdâtres ont apparu, avec cependant un peu de retard.

Dans une autre expérience au moyen des tubes de Roux dans lesquels nous avons introduit des gaz à l’hydrogène, les milieux sont restés stériles.

Si par ces expériences nous n’avons pu démontrer avec une rigueur définitive la non-intervention absolue de l’oxygène dans Île phénomène chromogène, nous nous croyons cependant en droit de conclure, que la bactérie sécrète la substance colorée même dans une atmosphère très pauvre en oxygène, et que d’autre part ce gaz ne joue aucun rôle dans le phénomène de caméléonage.

Essai de séparation du colorant par la méthode capillaire de GOPPELSROEDER, et action fluorescente du colorant sur les rayons lumineux de WOOD.

Dans la première partie de notre travail nous avons exposé les principes et les avantages de Ia méthode capillaire introduite par GOPPELSROEDER et permettant de séparer les différents principes des solutions complexes.

Nous avons donc eu recours à cette méthode qui, bien qu’elle ne nous ait pas donné les résultats attendus, nous a quand même fourni des indications utiles. Nous tenons à décrire ces expériences dans ce chapitre traitant Îles propriétés physiques du colorant sur les filtres.

Nous avons d’abord coupé du papier-filtre n° 598 dans la direction de la longueur des fibres de telle sorte que nous avons obtenu des bandes de 30 centimètres de longueur

et de 2 centimètres 1 de largeur, suivant les principes indiqués par PFAU (129). D'autre part, nous avons préparé des tubes de culture de grandeur appropriée, et sur lesquels nous avons fixé à la partie ouverte une agrafe recourbée. Puis nous avons suspendu les bandes de papier-filtre à lintérieur des tubes. Le tout a été placé à l’étuve à + 60° pour sécher. Après un séjour de deux jours à l’étuve nous avons introduit avec précaution à une hauteur de 2 em. 1, le fiquide coloré à examiner. Les tubes ont été de nouveau hermétiquement fermés au moyen de gutta-percha et nous les avons abandonnés au repos. Des analyses ont été faites à des températures constantes, à une pression égale, en éliminant les causes d’erreurs qui auraient pu intervenir par Îles différents degrés hygroscopiques de l'air.

Nous avons ainsi examiné des solutions rouges, des solutions verdâtres et des milieux incolores. Le tableau cidessous indique la vitesse de montée des zones colorées notées à différents intervalles et la hauteur terminale et définitive de l’ascension des zones colorées sur le papierfiltre. I1 faut faire ressortir ici que la substance chromogène produite par le Bacillus Citrulli est constituée par un seul et unique colorant, car nous n’avons jamais pu observer des bandes d’ascension séparées de colorant au cours de ces expériences au moyen de trois milieux de cultures.

Nous revenons encore sur la présence d’une seule zone colorée, preuve que notre pigment est formé d’une seule substance, qui est très stable. Dans les milieux verts ainsi que dans Îes milieux verdâtres nous avons quelquefois pu observer de faibles bandes de zone jaunâtre ou brunâtre, qui doivent être en relation avec des produits de décomposition du milieu, car en manipulant plus tard avec des solutions pures, nous n'avons pu constater ces zones.

Tableau d’ascension des colorants par la méthode

de GOPPELSROEDER.

Concen- | Période notée après une imbibi-

Substratum à tration tion de :

T0 A0 LOG 9 AlhSr8 hs2# hs

Milieu rouge | non dilué DONC IR TO SL OMS ODA Milieu

Merde A RON CAS RS 5, 70-30 di 137 Milieu inco- non dilué

ACT due SARO CO LE 7 106 10,3

Milieu rouge UÉ LITE |NLO A, TO 0, 12 CRIO DELTA C7, Milieu

redétemshudiuér nes ao CS MEL, 17.2 17,2 Milieu incoloc aces … dilué TUNIS 5 Me ET ONTS. OUT8,22,18,2

MilieuwrougerMi.dilué.r /4v 1x, 2:700 12, 106,7617,5: 17,5 Milieu

verdâtre difuénn des 7 rieO NO TATA A TS eT7,3 Solution pure

rouge. à... DOVE IL CLS OMR VAS TO ZA Solution pure

verte à OO0rLS HORROZ MO Sal LA IS 20d0,2

En examinant le tableau ci-dessus on peut se rendre compte que le pigment monte d'autant plus vite sur le papierfiltre que la concentration est moins faible et que la solution est plus pure. Le résultat final de l’ascension peut être considéré comme définitif après 18 heures d’imbibition; le maximum de hauteur est situé à 18,2 cm.

En général les solutions rouges ont une vitesse d’ascension beaucoup plus prononcée que les solutions vertes. La coloration verte atteint le maximum seulement dans Îa solution pure et dans ce cas la hauteur est identique à la couleur rouge.

Par contre en présence du milieu de culture l’ascension n’atteint jamais le maximum et il semble même exister dans le substratum à des dilutions très grandes, des substances inhibitrices vis-à-vis du pouvoir capillaire.

Dans le milieu incolore, ou nous avons seulement noté la hauteur du liquide aspiré, ces substances retardatrices semblent aussi exister, mais leur influence est moins prédominante.

Nous avons ensuite découpé des bandes de papierfiltre imprégnées pour en séparer les zones qui avaient absorbé les substances chromogènes, et en les traitant avec de l’eau distillée nous avons obtenu des solutions pures du colorant. Ces liquides nous ont servis pour effectuer des réactions chimiques que nous décrirons plus loin et qui ont toujours donné des résultats identiques à ceux obtenus à l’aide du colorant pur obtenu par cristallisation. D’autre part nous avons employé ces solutions et les bandes de papier-filtre pour analyser les propriétés de fluorescence de notre colorant par exposition aux rayons de Woop. Pour cette analyse nous avons employé la lampe à mercure en quartz à grand éclat intrinsèque et munie d’un filtre spécial en verre à l’oxyde de nickel, imaginé par WoopD qui laisse passer la raie ultraviolette de 3660 U.A. particulièrement intense. L/appareïl est construit par la Société Gallois et Cie , de Lyon et se compose essentiellement :

19 d’un brûleur à mercure en quartz très puissant,

laissant passer tout le spectre de mercure, à allumage automatique, type HENRI GEORGE, à 110 Volts et 8 Ampères 5.

20 d’un verre à l’oxyde de nickel n° 150, extrêmement sélectif laissant passer presque uniquement la raie très intense 3660 U. A.

3° d’une enveloppe métallique et d’un réflecteur muni d’un rideau noir, de sorte qu’on peut concentrer très énergiquement les rayons lumineux sur l’objet à analyser en évitant par la protection toutes autres sources lumineuses pouvant induire en erreur.

Nous avons obtenu les résultats suivants :

1° Ja solution aqueuse de pigment pur obtenu par cristallisation à une concentration de 0,01 *, donne une fluorescence violet laiteux; l’intensité lumineuse de cette solution est la plus forte et peut être désignée par comparaison avec les autres solutions par le chiffre 20.

2° la solution alcoolique (C2H5OH) à la concentration de 0,01 % est fluorescente surtout à la surface avec une teinte violet laiteux de même, mais lPéclat est beaucoup moins intense et l’intensité peut être exprimée par le chiffre 8. Le solvant a été exposé seul aux mêmes conditions, afin d'éviter les causes d’erreurs provenant d’une fluorescence propre à lalcool. Ceci a été pratiqué dans toutes les expériences que nous énumérons par la suite, et en cas de besoin nous avons tenu compte de ce phénomène accessoire. La fluorescence de la solution alcoolique à une concentration de 0,005 %, devient plus intense et nous avons pu nous rendre compte que l'intensité augmente en rapport direct avec la dilution de la solution jusqu’à 0,0005 % où il semble se produire une déviation de la courbe d’intensité vers {a diminution. Le maximum d'intensité peut être désigné par le chiffre 11,5.

3° La solution aqueuse alcaline (Na OH) donne une fluorescence violette, moins intense que la solution aqueuse pure sans réactif, mais le trouble laiteux est beaucoup moins prononcé et la solution irradiée reste limpide et transparente sur une couche de 3,2 centimètres d’épaisseur. L/intensité == 13.

4° La solution acide (HCI) sans chauffage donc non hydrolysée, donne à une concentration de 0,005 ‘, une fluorescence violet laiteux d’une intensité comparable à la solution pure de 0,01%. Des concentrations plus fortes ou plus faibles que 0,005 font diminuer l’intensité.

5° Les bandes de papier-filtre obtenues par la méthode capillaire sont uniformes et nettement limitées et donnent par une imprégnation au moyen du milieu de culture rouge dilué au quart, une fluorescence violette.

6° Les bandes de papier-filtre imprégnées du pigment en milieu alcalin verdâtre dilué au quart donnent une fluorescence violette uniforme, mais beaucoup moins lumineuse.

7° Les bandes de papier-filtre imprégnées au moyen d’un milieu acide hydrolysé par chauffage sont beaucoup moins fluorescentes et ont une teinte jaune verdâtre.

80 La solution du pigment hydrolysé dissout dans l’aicool amylique à 0,01 %, donne une fluorescence beaucoup moins intense (6) et devenant jaune blanchâtre.

0° Les bandes de papier-filtre imprégnées à l’aide d’une solution de pigment hydrolysé dans l’alcool amylique donnent des zones uniformes et nettement limitées, la teinte de la fluorescence est jaune brunâtre et l’intensité est plus forte que celle de la bande trempée dans l’alcool amylique pur.

b) Conditions chimiques de production du pigment. Rôle des matières organiques quaternaïires et ternares.

Nous avons, dans la deuxième partie de ce travail, assez longuement parlé du rôle de la composition du milieu de culture dans l’apparition du pigment.

Nous avons démontré que les subtances quarternaires n’interviennent aucunement dens ce phénomène. Nous avons d’autre part constaté que la végétation de notre organisme et l'attaque de l’asparagine dans notre milieu synthétique F. sont plus actives et plus profondes en présence d’hydrate de carbone, et que la coloration rose ou verte fait son apparition uniquement en présence de ces substances ternaires.

Par passages successifs en milieux dépourvus d’aliments sucrés, la production des substances colorées est considérablement affaiblie. Si on réensemence des souches cultivées pendant plusieurs générations sur des milieux privés de sucre sur milieu sucré, un grand nombre de tubes ensemencés restent invariablement incolores, et sur le petit nombre de tubes qui se colorent, on note une diminution très remarquable de l’intensité de la coloration. C’est seulement après plusieurs passages sur milieux sucrés que la bactérie récupère son pouvoir chromogène initial.

En somme l’aliment hydrocarboné favorise énormément la production des matières colorantes, l’aliment ternaire est rigoureusement indispensable à la réalisation du phénomène chromogène.

Rôle des sels minéraux

Dans leur publication A. et R. SARTORY et J.MEYER (130) concluent : «cultivée sur un milieu renfermant un hydrate de carbone, et un phosphate ou sulfate de magnésie en présence de chlorure de sodium la bactérie sécrète une matière colorante. »

Ce caractère rapprocherait notre bactérie du Bacille pyocyanique et de beaucoup d’autres bactéries chromogènes telles que B. prodigiosus, B. rosaceus metalloïdes, B. syncyanus, B. chlororaphis etc.

Afin de constater ces propriétés nous avons ensemencé une série de tubes avec notre milieu synthétique F. ne contenant cependant pas de sulfate de magnésie. La culture obtenue montrait en effet un développement retardé et la teinte rose a fait son apparition seulement vers le huitième jour. Quand nous repiquons cette culture une deuxième et une troisième fois sur des milieux sans sulfate de magnésie, on constate vers le quatrième jour l’apparition d’un trouble dans Îe milieu, la bactérie se développe, par conséquent la matière colorante fait encore son apparition vers le huitième jour, mais la coloration devient de plus en plus faible et de plus en plus longue à apparaître par rapport avec le passage progressif sur milieu sans magnésie. Ie sulfate de magnésie ne semble donc pas indispensable à la production du colorant, il favorise même à des traces infinitésimales la production du pigment. Des essais analogues ont été faits avec des sels de phosphate, ils ont donné des résultats identiques. La nature du sel ne semble pas jouer un rôle dans la production du pigment, mais la présence de traces de phosphore, soit à l’état organique, soit à l’état de sel minéral, a une action stimulante sur ce phénomène et l’élément phosphore quoique n'étant pas indispensable, favorise cependant le pouvoir chromogène de la bactérie.

Achon du fer

Connaissant les travaux importants de LASSEUR sur l’exaltation de la fonction chromogène de certaines bactéries par la présence de sels de fer, tels que le sulfate ferreux, le citrate ferreux, le chlorure ferrique, le sulfate de fer ammoniacal, l’alun de fer ammoniacal etc... et sur la production de substances mères des corps colorés par la présence même de traces de fer, nous avons effectué des cultures sur deux séries de tubes dont une était débarrassée complètement de traces de fer, tandis que l’autre correspondait à notre milieu synthétique F. avec 0,5 de sulfate de fer pour 1000 cc.

Nous avons cultivé les deux souches de bactéries pendant 5 générations sur milieu approprié, mais nous n'avons pu constater ni sur milieu alcalin, ni sur milieu acide, une différence dans la production du pigment. Nous nous croyons donc en droit de conclure que l’élément fer n’intervient pas dans la production et dans l’intensité de la matière chromogène.

c) Propriétés du pigment sur les milieux de culture.

Nature de la coloration

Dans les différents milieux ou nous avons constaté le phénomène de chromogénèse, les teintes observées dans les diverses conditions de culture ont été les suivantes :

19° Milieu glucosé et saccharosé à pH initial de 6,4: coloration rouge violet comprise entre les numéros 576 et 583 du Code des couleurs de Kliencksieck et Valette, Paris

29 Milieu glucosé à pH initial de 7,6 : coloration jaune verdâtre compris entre les numéros 202 et 205 du Code des couleurs précédemment cité:

3° Milieu saccharosé à pH initial de 7,6: coloration orangé-jaune correspondant aux numéros 181 et 182 du même Code des couleurs.

Solubilité

Nous avons vu au cours de ce travail, que le pigment se forme seulement hors du corps bactérien et qu’il diffuse très facilement et fortement dans les subtrats aqueux. Ceci nous indique déjà que le colorant doit être soluble dans l’eau et dans les solvants hydratés. En effet, l’addition au milieu -stérilisé et filtré de parties égales de glycérine, d’alcool absolu et d’acétone ou de chlorure de sodium jusqu’à saturation, ne modifie en rien les propriétés du colorant. Le milieu filtré à sa concentration initiale ou réduit de moitié par évaporation, agité en présence d’éther, de chloroforme, d’éther de pétrole, de sulfure de carbone, de tétra-chlorure de carbone, de benzène, de toluène et des matières grasses n’abandonne pas de trace de substance colorante à ces solvants.

Nous nous croyons par conséquent en droit de conclure dès à présent que le Bacillus Citrulli Sartoryi est soluble dans l’eau, dans l’alcool dilué, dans l’acétone, dans la glycérine, et qu’il est insoluble dans les autres solvants mentionnés plus haut.

Précipitation

Nous avons alors essayé de précipiter le colorant dans le liquide de culture. La solution concentrée par évaporation a été traitée par une solution d’acétate de plomb tribasique. On obtient des flocons bleu-verdâtre. Par addition d’une solution de sulfate mercurique le milieu clair se trouble lentement et donne un dépôt bleu. En ajoutant au milieu rouge du carbonate de soude, la teinte vire aussi au bleu, mais cette coloration n’est pas stable et passe bientôt au vett-jaunâtre.

Les méthodes de précipitation au moyen d’autres réactifs n’ont donné aucune satisfaction, car la substance chromogène semble très sensible vis-à-vis des réactions chimiques et il nous a paru impossible d'obtenir, sans modification profonde du colotant, un résultat rigoureux.

Action de la Filtration sur Les milieux de cultures et sur la substance colorante.

L'action des filtres sur les milieux de culture peut être considérée comme nulle. Le papier LAURENT, le papier n° 598 de SCHLEICHER et SCHULIL, les filtres de KITASATO et D’ARSONVAL laissent passer le colorant sans modification aucune deses différentes nuances. Les bougies de CHAMBERLAND sont traversées par le colorant sans changement, à condition que la concentration en ions H du milieu soit plus grande que 6,20. Au-dessus de cette réaction le liquide rouge passe avec la teinte verdâtre.

Absorption du colorant.

Le colorant ne peut pas être séparé du milieu de culture, par fixation sur du coton ou sur la laine. Le milieu filtré à travers une bougie de tale ou de charbon ou de magnésie calcinée ou de craie, n’abandonne que des traces de colorant à ces substances. La substance colorante est par contre fixée par le chlorure ou le nitrate de sodium. Au cours ne nos travaux nous avons cependant constaté que le colorant peut être

séparé presque complètement du milieu de culture par une filtration à travers une bougie de talc de 20 centimètres de hauteur et de 4 centimètres de diamètre, si on prend la précaution de chauffer au préalable le milieu, en présence de quelques gouttes d’acide acétique concentré, au B. M. jusqu’à réduction au moins de moitié.