ESSAIS DE SÉPARATION DU COLORANT

Premier essai de séparation par la méthode capillaire. (voir précédemment.)

Deuxième essai de séparation par l’action de différents solvants.

Les différents faits mentionnés antérieurement sur les propriétés de solubilité et de précipitation prouvent la grande difficulté que l’on rencontre dans ces conditions pour l’extraction de la matière colorante des milieux de cultures aqueux par voie chimique, difficultés qui n’interviennent pas dans l’étude des bactéries du groupe prodigiosus où des cocci chromogènes.

Après avoir vainement essayé d'aboutir à un résultat définitif à l’aide de la méthode purement chimique de THUMM et de la technique de LASSEUR, indiquées dans la première partie de notre exposé, nous avons obtenu un premier résultat plus satisfaisant par le mode opératoire suivant :

Après stérilisation des milieux de cultures liquides (qui n’altère en rien le pigment) nous avons filtré à travers une colonne de talc. Le filtrat clair a été évaporé dans le vide; le résidu est repris par de l’alcool à 80 °, filtré sur filtre de JENA (N° 3 G 3) évaporé dans le vide à nouveau, repris par de l’alcool à 96 ©, filtré sur filtre de JENA évaporé et repris par un mélange alcool acétone pur à 12. La solution ainsi obtenue a été divisée en deux parties après filtration. I/une a été examinée telle qu’elle, l’autre a été évaporée dans le vide jusqu’à réduction au tiers de son volume, nous y avons ajouté son volume de toluène. À l’aide de cette manipulation nous avons obtenu une DE brun violet, qui nage à Es surface du‘liquide. rer de 7 Après filtration cette substance ne se asoGE blé ti dans l’acétone, ni dans l'alcool, inais très facilement dans l’éau distillée. C’est ce produit que noùs avons utilisé au cours de nos recherches ionométriques avec nos milieux de cultures colorés.

Troisième essai de séparation du pigment.

Purification et caractérisation du colorant par cristallisation.

Trois réactions importantes nous ont frappé au cours de nos travaux et ont dirigé nos investigations vers la bonne voie. Ce sont les suivantes :

19 La possibilité d’absorber le colorant par une colonne de talc, après chauffage prolongé au B. M. en présence de quelques gouttes d’acide acétique cristallisable.

29 J/action d’une solution de carbonate de soude sur la solution rouge, occasionnant un virage au bleu passant au jaune, et dans des conditions données, possibilité de réversion de ce phénomène par addition d’un acide.

30 La réaction de précipitation au moyen de l’acétate basique de plomb, produisant des flocons bleuâtres.

Ces trois phénomènes semblaient en effet rapprocher notre pigment des anthocyanes, et nous savions que WEIGERT (131) et WILLSTÆTTER (132) ont tenté de diviser ces pigments d’après ces caractères en divers groupes :

a) les anthocyanes qui sont rouge en solution acide; en présence de carbonate de soude bleus; et précipitent en bleu par le carbonate de plomb. Le colorant est facilement sujet à une isomérisation à l’état incolore (rose, bleuet).

b) les anthocyanes qui sont rouges en solution acide; en présence de carbonate de soude bleus; et précipitent en bleu par le carbonate de plomb. Le colorant est très stable et ne se décolore que difficilement (vigne, myrtille).

c) les anthocyanes qui sont jaune-rougeâtre en solution acide; en présence de carbonate de soude bleus; et qui donnent avec l’acétate de plomb un précipité rouge (radis) ;

d) les anthocyanes qui sont jaune-rouge, ou bleu-rouge en solution acide; en présence de carbonate de soude violets:; et incolores à l’état d’isomérisation (pavot, pélargonium) :

e) les anthocyanes qui sont rouges en solution acide; qui en présence de carbonate de soude et observés en couche

épaisse sont rouges, observés en couche mince. vert- bleu, ou rouge-violet, où brun-rouge (œillet, aster) ;

f) les anthocyanes qui sont violets en solution acides rouges en présence de carbonate de soude et précipitent en rouge par l’acétate de plomb (betterave rouge).

Nous avons donc par la suite essayé de caractériser et d'isoler le colorant de notre substratum aqueux par la réaction des anthocyanidines d'ÉRDMANN (133) interprétée et mise au point par WILLSTÆTTER (134).

Le milieu de culture stérilisé est concentré en présence d'acide acétique, puis centrifugé et filtré. Le filtrat est mélangé avec du talc, avec lequel on prépare une bougie de 30 centimètres de hauteur et de 4 centimètres de diamètre. Le colorant est retiré de cette pâte introduite dans la bougie, au moyen d’alcool à 75° à chaud (+ 800). La solution ainsi obtenue est alors agitée au moyen d’alcool amylique, de façon à occasionner une séparation des liquides alcooliques et aqueux. La couche inférieure aqueuse renferme dans ces conditions tout le colorant. Après décantation on précipite cette solution aqueuse par l’alcool absolu, on sépare ainsi une forte proportion de pentosanes contenus dans le liquide. Le filtrat rouge pur est hydrolysé au B. M. pendant 3 /4 d’heure en présence d’acide sulfurique à 7 %,. Cette solution est ensuite agitée au moyen d’alcool amylique après neutralisation. Le colorant passe dans l’alcool amylique; celui est lavé à plusieurs reprises avec de l’eau distillée sans que celle-ci se colore. La solution amylique est évaporée et on obtient une masse amorphe, fortement colorée en jaune vert. La réaction d’'ERDMANN caractéristique pour les glucosides a été par conséquent positive.

Nous avons, d'autre part, effectué la technique suivante : 5 litres de culture stérilisés et concentrés en présence d’acide acétique, sont mélangés avec du tale, puis à cette pâte nous ajoutons peu à peu 6 centimètres cubes d’acide sulfurique à 4 % renfermant 10 % d’alcool à 90°. La pâte semiliquide rouge est introduite dans un tube de centrifugeuse (Jouax). Nous centrifugeons et nous obtenons un liquide surnageant coloré en rouge vif; le culot de talc est devenu rose pâle. Nous décantons cette solution alcoolo-aqueuse-acide et l’introduisons dans une ampoule à décantation en présence de 10 centimètres cubes d’alcool amylique. On agite vivement. La couche alcoolique se séparant après repos est colorée en fouge (à cause de la présence d’acide). Nous la séparons-et nous la lavons dans une autre ampoule à décantation avec une solution aqueuse d’acétate de sodium à 3 %. Le liquide de lavage enlève tout le colorant et l’alcool amylique devient presque incolore. La solution aqueuse est ensuite concentrée

dans le vide au tiers de son volume. A ce liquide concentré nous ajoutons à froid une solution aqueuse concentrée d’acide picrique jusqu’à ce que le liquide devienne légèrement trouble. On chauffe avec précaution pour faire disparaître ce trouble et on laisse cristalliser par le repos le picrate qui donne des prismes hexagonaux colorés très intensément en rouge (fig. I).

Par transformation au moyen d’un courant sec d’acide chlorhydrique ou sulfurique gazeux, dégagé dans la solution de picrate, on obtient des solutions de chlorhydrates ou de sulfates, précipitables par un mélange éther-éther de pétrole et cristallisables dans une solution alcoolo-aqueuse chlorhydrique ou sulfurique à 5 %. Le sulfate se cristallise sous forme d’aiguilles colorées en brun rougeâtre (fig. II), le chlorhydrate sous forme de plaquettes prismatiques vert-bouteille.

Propriétés physiques du chlorhydrate.

Ce sel est inodore, il possède une saveur astringeante rappelant faiblement celle du tanin, mais d’une intensité beaucoup moins prononcée.

Le chlorhydrate cristallisé dans l’eau-alcool est hydraté. Il perd son eau de cristallisation sans subir d’altération à + 105 ° dans le vide.

0,158 gr. ont perdu 0,0112 d’eau 0,185 - O,0132 . — soit en moyenne O,1715 — O0,0122. —

La perte en eau s’élève par conséquent à environ 7 % de son poids. Par simple exposition à l’air, le sel ainsi déshydraté reprend très vite son eau de cristallisation. Par une exposition prolongée le sel devient hygroscopique. Chauffé progressivement dans un tube étiré il fond à + 215 9° — + 2189 en brunissant et en dégageant des bulles de gaz. Chauffé au bloc MAQUENNE le chlorhydrate fond instantanément à + 224 ° donnant un liquide brunâtre qui dégage une odeur de phénol et qui finalement devenant noir, <harkonne en. donnant-une odeur de suere-brülé.

‘La détermination du pouvoir rotatoire a donné des résultats négatifs. I/essai a été effectué sur une solution aqueuse renfermant 0,0151 de chlorhydrate cristallisé pour

100 centimètres cubes. En solution alcoolique à 0,0034 % le résultat était le même. Les deux solutions étant colorées nous avons dû opérer au tube de un décimètre.

Le chlorhydrate est très soluble dans l’eau ordinaire: il est plus difficilement soluble dans l’eau distillée pure, dans l'alcool à 90 © à froid, dans l’acétone. Il est insoluble dans le chloroforme et le benzène. Dans l’eau de robinet le sel se dissout en donnant une coloration violette, probablement par transformation en sels calcaires. En solution aqueuse acide à froid, la teinte est très stable à la lumière et à l’obscurité. En solution neutre ou alcaline il y a décoloration rapide; par acidification la coloration réapparaît de nouveau.

Propriétés chimiques du chlorhydrate.

La solution du sel chlorhydraté précipite par l’acétate neutre de plomb en donnant des flocons bleu-verdâtre. Le sel est complètement éliminé de la solution. Le précipité plombique, bien lavé et délayé dans l’eau, est décomposé par l'hydrogène sulfuré. On filtre à chaud pour séparer le sulfure de plomb; puis on obtient une solution verte précipitable par l’alcool ou l’éther. La solution de chlorhydrate additionnée d’une trace de chlorure de fer donne une virage violet; de fortes proportions de chlorure de fer occasionnent une décoloration jaunâtre avec altération probable du colorant.

Le chlorure de zinc et le chlorhydrate sodé d’étain produisent une précipitation violette. Le chlorhydrate de notre sel est réduit par le zinc et l’acide acétique et par le bisulfite de sodium.

CHAPELCRE 1 Ve