CARACTÉRISATION ET CONSTITUTION DU COLORANT

Analyse élémentaire.

Le chlorhydrate anthocyanique chauffé dans un creuset en présence de sodium, émet des vapeurs à odeur de phénol.

Le charbon, repris par l’eau, donne une solution ne contenant pas de cyanure : le produit n’est donc pas azoté. Le dosage du carbone et de l’hydrogène a été effectué au tube ouvert dans un double courant d’oxygène. Nous avons employé Île sel désséché à poids constant dans le vide à a RTS |

Nous avons obtenu les résultats suivants indiquant la moyenne des deux expériences :

0,223 gr de produit anhydre ont fourni 0,103 gr. WHO;

0,223 gr. de produit anhydre ont fourni 0,409 gr. de CO ?,

par conséquent :

1 gr. de produit fournirait : 0,465 gr. d’eau et 1,833 gr. de COZ done UNE 18178 0N6T Ci :50 %.

Le poids moléculaire a été déterminé par la cryoscopie, au moyen d’une solution renfermant 0,01 % de colorant.

Le poids moléculaire a été trouvé :

Sachant que nous avons affaire à un anthocyane, nous avons alors mélangé à volumes égaux une solution aqueuse de notre chlorhydrate anthocyanique anhydre à 1 %, et une solutions d’acide sulfurique à 6 %. Nous avons fait l’hydrolyse en

tube scellé au B. M. bouillant pendant une heure. Le sel se dissolvait très vite dans la solution sulfurique. Après 10 minutes de chauffage la solution est complètement limpide. En retirant du B.M.nous voyons se former, le tube étant encore chaud, des cristaux en forme d’aiguilles aflongées très fines. La précipitation étant définitive nous avons filtré le liquide froid sur filtre de JENA, les cristaux ont été mis de côté pour un examen ultérieur, et le filtrat clair nous a servi pour caractériser les sucres.

Le dosage a été effectué par la méthode de BERTRAND, et nous avons trouvé pour deux expériences pratiquées :

1° au moyen de 0,214 gr. de chlorhydrate anh. 0,1453 gr.

2° au moyen de 0,197 gr. de chlorhydrate anh. 0,1340 gr. exprimé en glucose;

3° Moyenne pour 100 gr. : 68.07 %.

D'autre part, une partie de cette solution filtrée a été mélangée avec 0,5 gramme d’acétate de soude et 0,25 gramme de chlorhydrate de phénylhydrazine; le tout chauffé pendant deux heures au bain-marie a donné un précipité, qui cristallisé dans 15 centimètres cubes d’alcool à 50 ©, a présenté les caractères des glucosazones.

Nous voyons donc que notre colorant doit rentrer dans le groupe des glucosides. Le glucose a été libéré de cette solution par l’hydrolyse. Ceci est d’autant plus probable que nous avions dans notre milieu initial de culture du glucose comme matière ternaire et des ions Na comme sels minéraux.

Nous avons ensuite étudié les cristaux obtenus précédemment, ainsi que le produit d’hydrolyse obtenu en partant du milieu de culture et séparé par l’agitation avec l’alcool amylique. La solution évaporée nous a fourni une masse amorphe jaune verdâtre, que nous avons utilisée pour des expériences comparatives.

La détermination du poids moléculaire nous a donné des difficultés que nous n’avons pu vaincre.

La cryoscopie est impossible à effectuer dans l’eau et dans l'acide acétique par suite de l’insolubilité de notre substance.

Nous avons essayé d’en déterminer le poids moléculaire

au moyen d’un dosage alcalinimétrique. Mais le dosage alcalinimétrique est impossible à effectuer à cause de la colo-

ration verte de la substance, coloration qui empêche de voir le virage de la phénolphtaléine. Nous nous sommes donc contentés de doser par l’analyse élémentaire le pourcentage des éléments de ce corps. Le chlorhydrate anthocyanidique de notre substance a été déshydraté dans le vide à + 105 2. I1 devient par cette manipulation brun foncé et très hygroscopique.

0,202 gr. de substance ont perdu à 105° 0,0087 gr. 0,10 gr. de produit anhydre ont fourni 0,214 gr. de CO?. 0,10 gr. de produit anhydre ont fourni 0,0336 gr. de H°O.

Par conséquent :

H = 3,63% Ce58,35.% Cl=sroms0,

le tableau suivant exprime Îles chiffres correspondants pour les cyanidines isolées et préparées synthétiquement.

CPE NOIR CÉFPFONCI RETRO SCERCIEER CRE

Pélargonidine Cyanidine Oenidine Delphinidine CEE RER 58,72 55,81 55,06 53,17 É07 de 3,02 3,41 4,09 3,25 Cle 10,93 II,OI 9,68 10,48

Nous voyons, en comparant ces chiffres avec les résultats obtenus par nous, que le corps que nous avons isolé doit être identique à la pélargonidine :

trouvé Calculé pour, C'HOË Cl, —:806,5

GO AUOT eu 58,35 58,72 Le TRES 3,63 3,02 CE Sétoh Aéu 10,48 10,93

Ayant constaté que le poids moléculaire pour le chlorhydrate cyanique est de 804,35 et que la quantité de glucose renfermée dans ce sel est de 68,079 la formule globale de notre produit doit donc correspondre à :

CSH#O*, 3H20 donnant par hydrolyse : CSH1OS C1 + 3CH%OS.

P. M. pour C*H“O%, 3H? O — 810 renfermant 6,66 °/, de son poids en eau.

Pa MPOUC AS ACT 702,4:

calculé trouvé LÉ Se EE 49,96 50 % 1 5 Di SR pe 5,173 SE70 0%

Nous voyons que ces chiffres sont très semblables et notre bactérie semble fabriquer un produit correspondant à la formule :

CHFOVEE

En effet les cristaux isolés après l’hydrolyse ont des propriétés analogues à la pélargonidine. Les cristaux présentent sous le microscope la forme en aiguilles allongées colorées légèrement en jaune, avec une crête violette facilement observable au moyen d’une fumière légèrement diaphragmée (Fig. III).

Ces cristaux sont facilement solubles dans l’alcool absolu et alcool amylique. Ils sont insolubles dans les acides minéraux, dans l’éther, le chloroforme, le sulfure et le tétrachlorure de carbone.

Le colorant se forme dans le milieu à l’état de sel basique d’un glucoside; ces constatations obtenues par voie chimique sont appuyées par nos observations antérieures suivant lesquelles la substance chromogène se produit seulement dans les milieux renfermant des hydrates de carbone en présence d’ions sodium ou potassium.

Nos cultures ont montré d’autre part que la substance chromogène n’exige pour sa formation que des traces d’oxygène. En présence de traces d’alun de potasse, le pigment vire vers le violet.

Le colorant en solution aqueuse (sel chlorhydrique ou sulfurique) est violet; en solution alcoolique rouge; la solution aqueuse légèrement acide est rouge lie de vin; en présence d’alcalis, nettement violette; le produit d’hydrolyse vert colore une solution alcoolo-aqueuse en jaune; la couleur de la couche anhydrique après hydrolyse est violet-bleuâtre.

Toutes ces réactions semblent démontrer nettement que notre colorant est un glucoside du groupe des anthocyanes

caractérisés par ComBEs (135), WILLSTAETTER (136) et son école: il est hydrolysable par action prolongée et surtout par la chaleur en glucose et anthocyanidine qui est insoluble dans l’eau et passe dans l'alcool amylique (réaction d'ERDMANN).

Analyse 1onométrique

Ayant constaté lors de l’étude sur les caractères culturaux de notre bactérie, que l’apparition de la substance chromogène est conditionnée par la température et par la concentration initiale en ions H du milieu, qu’il devait donc exister un rapport direct entre le phénomène chromogène et ces deux facteurs, nous avons pensé utile d'examiner ces influences au moyen du produit colorant pur. Nous nous sommes servis, vu les grandes difficultés de préparer le colorant à l’état cristallisé et des quantités minimes résultant de cette technique, de la méthode de purification indiquée dans le deuxième chapitre, du deuxième essai de purification.

En vue de l’étude des propriétés de virage sous l’influence de la variation de la concentration en ions H, nous avons eu recours à la méthode suivante :

Nous avons préparé une échelle de tampons à l’aide du potentiomètre à électrode d’antimoine de pH: 1,93 2,93 3,53 3,85 4,48 4,89 5,46 5,63 6,43 7,33 10,84.

De plus, nous étant rendu compte de l’influence de la température quant à la production du phénomène chromogène, nous avons effectué des expériences à différentes températures (+100 +180 +350 +450 +550 +#00 +ogo0).

Des tubes contenant 5 cc. de tampon et respectivement 5 gouttes ou 2 cc. de milieu coloré ou de matière colorante purifiée en solution aqueuse ont été placés dans des thermostats réglés aux différentes températures ci-dessus mentionnées; on à ainsi pu constater que le virage est fonction de la température et du temps de séjour à cette température donnée.

Les tableaux qui suivent expriment les résultats de ces expériences (les + — coloration; les — — décoloration).