L++++ L+++++) LE+L

+++++++ LEH+H++ ++++++ | ++++++ | ++++)

températures de

+++ ++ ++H++++ FÉRE]

V. Séjour de 180? aux températures de 1,93 2,96 3,53 3,85 4,48 4,80 5,46 5,93 6,43 7,33 10,84

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Nous avons essayé d’exprimer les résultats obtenus dans le tableau ci-dessous :

t5 temps pH.

1,93 2,96 3,53 3,85 4,48 4,89 5,46 5,93 6,43 7,33 10,84 909 60 — — — — — — COPPO PL TE 700 120

RCE re rar dd

709 607 — 552 120? — DOC 459° 120 — 352 1207 — 180 1807 — 180 1207 — “ER. = 100 T Re

Pour les réactions effectuées au moyen de milieu de culture, la décoloration complète se produit déjà à + 680 après un passage de 60? au thermostat. Mais déjà à la tempéra-

ture de + 55° les zones limite de décoloration sont restées définitivement fixées au pH = 1,93 et au pH — 6,43.

L+H+++++ HH+++H+++ HH+H+H+++ ++++++++) +HH+H+H+++ HH+H+H+++H+H+ | ++++)

Nous voyons donc que le virage peut être défini par une courbe qui est fonction du pH, de la température et de la durée du séjour à une température donnée. Tandis qu'à + 5° toute la série des tampons comprise entre les pH 1,93 et 10,84 reste colorée en rouge, un séjour de une heure à + 90° amène la décoloration dans toute la série. En nous

reportant au tableau précédent nous pouvons nous rendre

compte que les pH de 2,96 à 5,93 sont les moins influencés par la température et leur virage dépend principalement de la concentration en ions H. En effet le sommet de la courbe se trouve au pH = 5,46 environ; nous avons pu constater en outre que les liquides colorés de pH — 5,93, décolorés sous l'influence de la température ont repris leur teinte rouge par refroidissement, tandis que les tampons de pH supérieur à 5,93 sont restés définitivement incolores; la réaction de virage peut se faire dans les deux sens en augmentant ou en diminuant la concentration en ions H. Cette opération s'effectue le plus brusquement dans les limites de température comprises entre + 559 et + 709. Dans ces conditions la concentration limite nécessaire pour la production du virage est réalisée pour un pH — environ 6,3.

D'un autre côté il existe une zone limite acide pour laquelle le pH joue un rôle principal. Au pH = 1,93 il se produit une décoloration constante sauf à une température inférieure à —+ 10°. Dans ce cas aussi le colorant ne subit pas de modifications : en augmentant la concentration en ions H on arrive toujours, en égard avec la température à obtenir le virage; dans ce cas les limites de températures supérieures et inférieures pour lesquelles la décoloration se produit, sont très éloignées l’une de l’autre. Ces caractères viennent encore appuyer les résultats constatés antérieurement et nous montrent que nous avons affaire à un dérivé anthocyanique. Car nous savons depuis les travaux de WILLSTAETTER que ces corps sont des dérivés du phénylbenzopyroxonium, ou pyrylium. «Celui-ci existe sous deux formes, dont l’une donne des dérivés incolores, l’autre fournissant des sels colorés. On admet que cette seconde forme diffère de la première par la place de la double liaison qui ne se trouve plus entre les deux carbones centraux, mais entre les deux sommets 2 et 3. Les sels des dérivés hydroxylés du pyrylhium sont en général rouges; les dérivés dans lesquels l'hydrogène d’un OH est substitué par un métal sont bleus; enfin on a des composés violets par l’union de l’oxygène de OH avec l’oxygène basique.» (THOMAS (137), cours de chimie biologique II, 1920, p. 307).

Nous avons vu au cours de notre travail que les quatre modifications du colorant peuvent faire leur apparition dans les milieux de culture, suivant leur différente composition et les conditions auquelles ils sont exposés.

Analyse spectroscopique

Les recherches spectroscopiques ont été pratiquées au moyen de plusieurs liquides de concentration différente :

19 Avec le bouillon de culture stérilisé et filtré à un DÉLE= 60,24:

29 Avec la substance purifiée à l’aide de l’extraction par l’alcool-acétone à une concentration de 200 millièmes de milligramme et un pH — 4,24 en solution aqueuse.

3° Avec la substance cristallisée à l’état de sulfate d’anthocyane. On a fait une solution aqueuse à la concentration de 200 millièmes de milligramme et le pH de cette solution était de 5,44.

4° Avec la substance cristallisée à l’état de chlorhydrate d’anthocyanidine dans une solution alcoolique à une concentration de 200 millièmes de milligramme et un pH de 7,2.

Tous ces examens ont été pratiqués sous une épaisseur de 15 mm. et à la température de + 18° aux moyens de sels cristallisés à la concentration et aux pH indiqués ci-dessus.

a) La première solution nous a donnée une bande d'absorption très intense qui s'étend entre à — 588 et À — 543 avec un maximum pour À — 5063.

Une deuxième bande d’absorption moins intense s'étend de à — 513 à À — 489, son maximum est à 510. La zone intercalaire éclarée à son maximum d'intensité pour à = :,33.

b) En ce qui concerne le deuxième cas, les deux bandes d’absorption sont situées la première entre À = 582 et À — 543; la seconde entre 513 et 492. Leurs maxima sont À = 563 et À — 507. L/axe de la plage intercalaire éclairée

est situé à À — 528.

c) Dans le troisième cas où nous avons affaire à de {a substance cristallisée pure, nous avons pu noter deux bandes d’absorption situées entre À — 582 — 552 et À = 513 — 405.

Leurs maxima d’intensité se trouvent à À — 566 et À = 509. Le maximum d’intensité de la plage lumineuse intercalaire est à À — 528.

d) Dans le quatrième cas concernant le sel anthocyanidique, nous avons constaté une déviation vers le rouge avec une bande très large située entre À = 568 et À — 478. Cette zone montre deux maxima dont l’un est situé à x

— 550 et l’autre à À — 500. Une deuxième bande d’absorption commence à À — 438 et ici l'intensité diminue progressivement jusqu’à disparition complète.

Aïnsi des variations d’intensité de deux unités de pH (PH = 6,24 à pH — 4,24) ont pour effet de faire varier d’une manière insignifiante les places des bandes d’absorption.

En outre, le substrat de dissolution de notre colorant ne semble pas avoir une grande importance pour la caractérisation spectroscopique, car nous obtenons des résultats très comparables en employant trois milieux colorés de composition très variable et renfermant la substance chromogène à l’état naturel, à l’état amorphe, ou à l’état cristallisé.

Quant au spectrogramme du sel anthocyanidique nous constatons une grande analogie avec celui de la pélargonidine indiqué par WILLSTAETTER et ZECHMEISTER. Les différences observées dans les valeurs peuvent être en rapport avec l’épaisseur des couches et la concentration en ions H des solutions et considérées comme de l’ordre de grandeur des erreurs expérimentales.

Analyse biologique.

Après avoir ainsi constaté la nature du pigment produit en présence de glucose par notre bactérie, nous avons étudié l’influence des autres hydrates de carbone sur ce phénomène; ces matières ternaires ont été introduites seules où combinées avec d’autres substances, occasionnant des modifications sur les dérivés des anthocyanes.

Ainsi des milieux de saccharose donnent ordinairement des teintes roses et jaunes. Le résultat est identique pour le maltose. En présence d’amidon de blé ou d’amidon de pomme de terre nous obtenons des teintes plutôt violettes. Si on ajoute à ces milieux des traces d’alun de potasse, on obtient des colorations rouges où le substrat reste incolore.

D'autre part, les milieux filtrés deviennent nettement rouges par addition avec précaution d’acide chlorhydrique, d’acide sulfurique et d’acide acétique. Par addition d’alcalis cette teinte vire à froid ou par un léger chauffage, au vert. Cette teinte n’est plus stable et le milieu se décolore après un certain temps.

I/addition d’alun de potasse, de chlorure de lithium, de nitrate de potassium, de chlorure de strontium, produit de même une coloration rouge intense et très stable.

Par addition d’alcalis on obtient d’abord une teinte verte qui, si l’on augmente {a concentration, devient jaune. La couleur verte peut être ramenée au rose par addition d’acide, mais la coloration jaune ne peut plus être modifiée. La coloration verte apparaît aussi en présence de borate de soude, de tartrate neutre de potassium et d’acétate de plomb tribasique, à une faible concentration.

Des solutions colorées saturées avec du chlorure de sodium, nitrate de sodium, ou chlorure de baryum sont très stables, et gardent leur coloration invariablement.

D'autre part, afin de contrôler aussi la différence de notre substance chromogène avec des toxines bactériennes, nous avons effectué des expériences sur des animaux de laboratoire. 10 cc. de solution concentrée de la substance chromogène purifiée par extraction à l’alcool-acétone ont été inoculés par voie intrapéritonéale à un cobaye et 5 cc. de la même solution injectés par voie sous-cutanée à une souris. Les animaux n’ont montré aucun symptôme d’intoxication.

Un lapin a été, d’un autre côté, inoculé dans la veine auriculaire à différentes reprises pour observer les phénomèes d’anaphylaxie. Le résultat a été négatif. 20 cc. du sang de ce lapin ainsi préparé ont été retirés par ponction au cœur. Ce sang a été mélangé avec parties égales de solution du colorant. Nous n’avons pu constater ni précipitation, ni lyse des globules, notre colorant n’est donc pas un antigène.

Nous croyons ainsi, par l’analyse chimique, spectroscopique et biologique avoir pu démontrer la nature anthocyanique de notre matière chromogène.

Ces faits nous paraissent d’autant plus intéressants qu’à notre connaissance la littérature biologique ne signale que deux cas: celui de REINER-MUILER, décrit en détail dans notre premier chapitre, et celui de LEHMANN où fut mis en évidence la production d’un pigment sécrété par deux bactéries (Bacillus cælcolor et Bacterium anthocyaneum) pigment rentrant dans le groupe des anthocyanines, qui sont des colorants végétaux. Notons également que, comme nous, les auteurs ont isolé en même temps que la bactérie, un champignon inférieur rose qui vivait commensalement

sur le même substrat, ou la même plante parasitée. Ce champignon devient par la suite, en culture pure, incolore, et nous nous demandons s’il ne produit pas une excitation spécifique sur la bactérie, influençant la production du pigment végétal ?

Il nous reste à envisager la question suivante: Par quel moyen la bactérie arrive-t-elle à produire un corps dont la structure est assez compliquée, malgré que sa synthèse est encore facilement réalisable ?

En effet, nous pouvons préparer ces dérivés anthocyaniques par simple condensation de l’aldéhyde salicylique avec l’acétopbhénone pour obtenir en présence d’acide chlorhydrique le bhénylbenzopyroxonium. Ies divers sels glucosidiques de loxypyrylium constituent alors les anthocyanes.

ZECHMEISTER a réalisé la synthèse de la pélargonidine en partant d’un halogène arylé du magnésium combiné à la coumarine. Nous avons donc essayé d'augmenter le pouvoir chromogène en ajoutant de la coumarine à notre milieu synthétique F., à des doses variables. Mais le résultat n’était aucunement modifié et nous n’avons pas pu constater une augmentation dans la production du colorant.

Nous n’avons donc pas réussi a élucider cette question qui nous aurait permis d’éclaircir les phénomènes présidant au mécanisme de synthèse biologique et de déterminer le pouvoir constructeur du métabolisme bactérien en ce qui concerne la formation de la matière chromogène.

Toujours est-il que grâce à cette substance chromogène glucosidique, la bactérie peut couvrir ses besoins énergétiques dans un milieu acide et dépourvu de substance quaternaire organique.

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