LES MÉTHODES DE DOSAGE DES FERMENTS LIPOLYTIQUES

La plupart des méthodes de dosage des enzymes lipolytiques reposent soit sur des techniques titrimétriques directes en rapport avec les Acides gras formés, soit sur les modifications de la tension superficielle des solutions à base d’Esters, à la suite de l’action enzymatique.

Pour le dosage des Lipases on peut avoir recours aux méthodes suivantes :

La technique gazométrique : l’Acide gras dégradé agit sur du Bicarbonate en libérant de l’Anhydride carbonique. On mesure par voie manométrique la pression des gaz ainsi formés.

La technique néphélométrique : qui mesure l’intensité de l’opacité d’une émulsion formée par la Trioléine ou la Tributyrine.

La technique volumétrique : par la mesure des modifications du volume des mélanges mis en réaction.

Les méthodes de dosage les plus importantes employées actuellement (Selon BAMANN et MYRBÂGK)

1) La méthode alcalimétrique de la Lipase pancréatique au moyen de graisse proprement dite :

D’après WiILLSTAETTER et WALDSCHMIDT-LE1Tz (32), cette méthode est employée le plus souvent pour les recherches quantitatives. du pouvoir lipolytique sur l’Huile d'Olive. Les caractéristiques des Lipases pancréatiques les plus marquées sont leur dépendance du système colloïdal dans lequel l’action enzymatique se manifeste. Aucun autre enzyme ne dépend autant du substrat environnant que ces Lipases. La technique de WILLSTAETTER tente d’éliminer les facteurs secondaires du système lipolytique. Ceux-ci sont dûs aux taux variables des substances activantes ou inhibantes ; ces causes d’erreurs sont évitées par l'addition en excès d’activateurs ou d’inhibiteurs nettement connus. L’activation est réalisée de telle sorte qu’une solution enzymatique relativement pauvre en substances secondaires, par exemple, en extrait glycériné de poudre de Pancréas déshydraté, peut être comparée à une poudre connue de cette glande. On essaie par conséquent beaucoup plus de réaliser un équilibre du phénomène d’activation que la production d’une activité enzymatique optimum.

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Principe de la méthode:

On emploie, selon le principe ci-dessus indiqué, des activateurs capables d’équilibrer la réaction: on utilise pour la décomposition des graisses véritables, en milieu-alcalin, les activateurs suivants: des protéines, des sels biliaires ou des savons de chaux. qui se forment par l’addition de sel de Calcium soluble en présence des Acides gras libérés. La théorie de cette activation n’a pas pu être expliquée indiscutablement jusqu’à nos jours.

WILLSTAETTER estime que ce phénomène est basé sur la production de particules colloïdales agissant commme adsorbants tant vis-à-vis de l’enzyme que vis-à-vis du substrat réactif. La réaction est donc ainsi facilitée. Les processus inhibants qui peuvent cependant se manifester au cours de la réaction, s’expliquent d’après l’auteur par l’absorption du ferment, même. c’est-à-dire par la concurrence entre la substance secondaire et le substrat réactif vis-à-vis du ferment.

La Lipase est utilisée sous forme de poudre de Pancréas desséchée et pulvérisée ou en solution, par exemple : un extrait glycériné à partir de la glande desséchée. D'après la méthode de WILLSTAETTER, on doit ajuster la réaction ionique du milieu au moyen d’une solution tampon d’Ammoniaque et de Chlorure d’Ammonium. La réaction s’effectue à un pH de 8.9 et à une température de 309. On doit utiliser une dose insuffisante de solution tampon par rapport à la quantité d’Acide oléique mis en liberté. On renonce donc au maïntien constant de la concentration ionique. étant donné que l’emploi d’un excès de tampon fortement alcalin endommage l’enzyme même. La dégradation débute donc en milieu alcalin et la réaction d’un mélange analytique en expérience devient neutre à un taux de 8,5 %, de décomposition ; elle correspond au moment de la saponification maximum, à 24%, alors que le pH est de 5,5.

Mode opératoire:

On introduit dans un flacon de 30 ce à large ouverture, bouché à l’émeri, les produits suivants dans l’ordre indiqué ci-dessous:

Substrat enzymatique + Eau distillée ....... 10," ce

EU PERE A P COORE PORN ET CP PIONEER TETE 242.00

Solution tampon RE PR EP RS À LT

Solution de Chlorure de Calcium à 2% ..... 0,5 ce Agitation brève et soigneuse, puis addition de:

Solution protéique ......................:.. 0,5 ce

En agitant à la main durant 3 minutes on déclenche la saponification, qui s’effectue lentement au début avec formation d’un précipité d’Oléate de calcium.

Pour effectuer le dosage titrimétrique, on tranvase le contenu total du petit flacon dans un ballon d’Erlenmeyer en lavant au moyen d’Alcool à 96° pour obtenir un volume total du liquide alcoolique de 125 ce. On

effectue ensuite la solubilisation complète de l’Huile au moyen de 20 ce d’Ether. On emploie comme indicateur 12 gouttes d’une solution alcoolique de Thymolphtaléine à 1 %. On pratique le dosage au moyen d’une solution alcoolique de Potasse N/10 ou si c’est nécessaire de KOH N, jusqu’à obtention du virage du liquide en expérience au bleu net. On fera parallèlement un essai au moyen d’une solution témoim sans Huile d'Olive.

2) Méthode stalagmométrique :

La méthode stalagmométrique a été élaborée par RoNA et MIcHAE- Lis (33) et surtout par WiLLSTAETTER et MEMMEN (34). Elle est basée sur la mesure de la modification de la tension superficielle réalisée par l’hydrolyse de la Tributyrine. Lors de la saponification de la Tributyrine, comme pour la dégradation lipasique des graisses, le dosage rigoureux de la Lipase ne devient possible que par l’élimination des substances accidentellement présentes, activant ou inhibant secondairement le processus lipolytique. Ces facteurs sont éliminés par l’addition en excès de réactif activant. Ceci peut être obtenu par l’action combinée de l’Albumine d’œuf et du Chlorure de calcium, introduits dans le mélange en expérience. On utilise d’autre part une solution tampon d’Ammoniaque et de Chlorure d’ammonium en ajustant à 180 le mélange à pH — 8,6. Pour effectuer cette réaction des doses de 1/100€ à 1/500€ de la quantité de substrat lipasique employé dans la méthode alcalimétrique sont nécessaires. Comme substrat-réactif on a recours à une solution saturée aqueuse de Tributyrine. La Tributyrine du commerce est d’habitude impure par la présence de Dibutyrine, et il est ainsi impossible de préparer les solutions à propriétés expérimentales constantes. Il faut d’abord éliminer la Dibutyrine, plus hydrosoluble, par des lavages successifs. On obtient un produit suffisamment pur en épuisant à onze reprises 50 g de Tributyrine du commerce par agitation prolongée dans 400 ce d’eau distillée chaque fois. La Tributyrine peut être considérée comme pure, si l’on obtient au moyen d’une dose assez forte (5 à 10 g) agitée avec 200 ce d’eau, une solution donnant le même nombre de gouttes qu’une solution ne contenant que trois gouttes de réactif.

Mode opératoire:

On tente tout d’abord, par des essais préliminaires, de déterminer la dose appropriée de l’'Enzyme que l’on doit mettre en expérience. On

introduit ensuite dans ce substrat lipasique: Solution d’Albumine d'œuf à 3 % Solution de:Chlôrure de 0416 0e PR PRE 0,5sce Solution saturée de Trbutyrinesss Ses EN RRRT SRReE 56,0

Solution tampon Ammoniaque + Chlorure d’ammonium . 2,0 cc Solution d’Oléate de soude à 2 % q.s. p.

Le mélange doit être effectué à 18° et on doit l’ajuster à un pH — 8,6. On mesure immédiatement par un premier prélèvement du mélange le nombre de gouttes s’écoulant du Stalagmomètre. On dispose le liquide en expérience à 209 et on effectue le dosage de 20 minutes en 20 minutes, à trois ou quatre reprises, en déterminant la diminution du nombre des gouttes.

On étalonne tout d’abord le Stalagmomètre au moyen d’eau distillée à 189; puis on remplace celle-ci par la solution saturée de Tributyrine ; on établit ensuite une courbe du taux de Tributyrine en pratiquant des dosages au moyen de solutions diluées de Tributyrine diminuées chaque fois de 10 %. On inscrit les nombres de gouttes ainsi obtenus en ordonnées et le pourcentage en abscisses, pour tracer ensuite la courbe. Celle-ci permet de lire directement le taux de Tributyrine d’une solution en rapport avec la solution saturée initiale. WIILLSTAET- TER et MEMMEN considèrent, pour la détermination de l'extrait lipasique, les relations entre le nombre de gouttes et la vitesse de réaction. Ils ont établi ce rapport au moyen d’un substrat lipasique provenant de Pancréas de porc. Leur Unité lipasique proprement dite, c’est-à-dire la dégradation de l'Huile, se rapporte à celle de la Tributyrine et représente une simple fraction, c'est-à-dire 0,001 Unité de celle-ci. On conçoit ainsi que le rapport: dégradation d’'Huile / dégradation de Tributyrine n’est pas toujours analogue pour les substrats lipasiques utilisés, de sorte qu'il est plus ou moins rigoureux.

3) La méthode gazométrique ou manométrique,

que nous avons brièvement mentionnée au début de ce chapitre. Cette technique n’entrant pas dans le cadre de notre travail, nous renvoyons pour les explications et le mode opératoire au travail de BAMANN et MyrBÂCK (36).

4) La méthode néphélométrique :

Le dosage néphélométrique repose sur la mesure de l'intensité de l’opacité d’une émulsion formée par un substrat colloïdal. Etant donné que cette opacité du substrat se trouve en relation directe, au cours des expériences, avec la concentration. l'intensité du trouble, mesurée à différents intervalles au cours du processus de dégradation, donne une image précise de l’action lipasique.

Pour effectuer ces mesures on emploie des opacimètres ou des néphélomètres, tel que celui de KLEINMANN (37) ; pour les dosages de Lipases, Roxwa et KLEINMANN (38) mesurent la diminution de l'intensité opacimétrique d’une suspension de Trioléine, occasionnée par l’action de la Lipase : il faut éviter l'intervention des Acides gras mis en liberté qui forment eux-mêmes une émulsion et peuvent ainsi augmenter le degré d’opacité. Pour cette raison on effectue le dosage dans un mélange d’Oléine-Glycérine-Ammoniaque, dans lequel les Acides gras se dis-

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solvent facilement et ne peuvent plus induire en erreur. Par le taux en Ammoniaque, la Trioléine forme un savon réalisant ainsi une émulsion stable dont on peut facilement mesurer le degré d’opacité.

D’après les recherches de HERZFELD (39), on emploie pour mesurer l'intensité turbidimétrique, une suspension témoin de Tributyrine stabilisée par l’addition de gomme arabique.

5) Méthode ionométrique :

Principe du dosage du pouvoir lipolytique au moyen du pH-Mètre.

La méthode alcalimétrique de WILLSTAETTER est basée sur les principes suivants: Doser titrimétriquement les Acides gras mis en liberté par l’action enzymatique soit à partir d’une graisse proprement dite, soit à partir d’un substrat plus hydrosoluble, tel que le Butyrate d’éthyle, par exemple.

En ce qui concerne les Lipases proprement dites, on détermine leur taux d’activité au moyen de la solution de Potasse alcoolique et en rapportant les résultats à la définition donnée par l’auteur qui a trait à24% d’Acides gras libérés à partir de 2,5 g d’Huile d'Olive au cours d’une heure d’action enzymatique dans des conditions expérimentales nettement définies.

Nous avons essayé de modifier cette méthode alcalimétrique de Wirx- STAETTER en l’adaptant, pour le mieux, aux principes régissant l’utilis sation d’un pH-Mètre électrique ; en employant cet appareil nous dosonles Acides gras libérés de 2,5 g d’Huile d’Olive en relation avec la quantité de Soude nécessaire pour ramener la concentration ionique du substrat enzymatique au pH initial.

Les potentiomètres habituellement utilisés emploient soit une électrode à Hydrogène, au Calomel, à l’Antimoine ou en verre. Toutes ces méthodes sont basées sur la mesure d’un potentiel de concentration en ions H variant suivant l’ionisation des différentes solutions à étudier. Ce potentiel dépendant du pH d’une solution témoin, ne peut pas être mesuré directement pour une solution inconnue ; il faut de ce fait avoir recours à une deuxième électrode de comparaison, de sorte que l’on mesure le potentiel différentiel entre l’électrode témoin et l’électrode en contact avec la solution à doser.

Nous avons pu employer un pH-Mètre existant au Service de Microbiologie de la Faculté de Pharmacie de Strasbourg, dont la manipulation est très simple, permettant d’obtenir des résultats rigoureux et constants. Nous avons pu apprécier au cours de notre travail les qualités de cet appareil, qui nous a permis de résoudre dans une large mesure le problème qui se posait à nous (*).

(*) L’appareil en question est fabriqué par les Établissements MÉTROHM SA, Herisau (Suisse).

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Nous donnons ci-dessous la description et le mode d'emploi de l’ins-

trument.

Technique de manipulation du pH-Mètre :

Généralités :

Lors de l'installation de l'appareil. il faut prendre les précautions

suivantes :

1) L'appareil est muni d’un dispositif permettant le branchement sur différents réseaux électriques : nous l’avons utilisé sur un courant de 220 Volt 50 Herz. courant alternatif.

2) Il est muni d'autre part, à sa partie postérieure, d’un pôle permettant de le relier à la terre.

Mise en marche du pH-Mètre :

Nous donnons cicontre un schéma indiquant les différents dispositifs de l’appareil, ce qui permet de comprendre plus facilement les explications données dans le texte.

Relier l'appareil au courant de secteur. Placer le commutateur(7) en position «calibre ».

par une rotation à droite. Il est nécessaire d'effectuer cette manipulation avant de relier l’appareil définitivement au courant.

En tournant l'interrupteur (2) vers l’arrière, le pH-Mètre est prêt pour l'usage, stade indiqué par l'allumage de la lampe témoin (3).

À ce moment, on note une déviation à droite de l'aiguille (1) de l’instrument ; celleci revient après quelques secondes vers sa position initiale. À par-

Figure 2

tir de ce moment, on attendra deux minutes, temps nécessaire pour chauffer l'appareil. On équilibre, au moyen du régulateur (6) du potentiomètre, l'aiguille exactement sur DHI=N 00: marqué sur l'échelle de l’appareil. On lave l’électrode au moyen d’eau distillée, manipulation qui doit être répétée chaque fois avant l'introduction de celle-ci dans la solution à étalonner.

On remplace alors l’eau distillée par le liquide à examiner. Décaler à ce moment le commutateur (7) de la position «calibre » droite, en position marquée « pH », se trouvant à gauche. Cette opération permet la lecture directe du pH sur l’échelle de l'instrument. Après chaque lecture le commutateur (7) doit être immédiatement ramené en position «ealibre» droite, pour éviter, par l’échange des liquides de lavage et d’expérience, une oscillation trop brusque de l'aiguille.

Etalonnage de l’appareil :

L'appareil doit être étalonné de temps en temps, pour éviter des erreurs dues à des modifications dans la chaîne électronique. A ce sujet, on procédera de la même façon que pour une mesure normale; mais au lieu d'employer une solution quelconque, on utilise de préférence une solution-tampon phosphatée de pH — 7,0. Pour ce faire, on ajuste l’appareil tel que nous l’avons décrit ci-dessus, on régularise la température en rapport avec celle de la solution-tampon au moyen du régulateur de température (5). Cette opération évite des erreurs dues à la différence de température qui pourrait exister entre la solution-tampon et les liquides à examiner.

Ces précautions prises, on ramène le commutateur (7) de la position «calibre » droite, en position « pH » gauche. Si à ce moment l’aiguille de appareil ne s’équilibre pas à pH — 7,0 indiqué sur l’échelle, on aura recours au régulateur rouge (6), qui permet de ramener l’aiguille exactement sur le degré de pH de la solution-tampon. Après cet étalonnage préalable, on ramène le commutateur (7) de nouveau vers la droite sur position « calibre ». Cette manipulation a pour conséquence une légère déviation de l'aiguille, qui est corrigée en ramenant, avec le bouton régulateur (8) du potentiomètre, l’aiguille en position exacte de pH — 7,0.

L’étalonnage est ainsi terminé et l’appareil est prêt pour les mesures.

Précautions générales pour les soins de l’appareil:

Si l’appareil n’est pas en usage, l’électrode doit être constamment immergée dans l’eau distillée. Celle-ci doit être renouvelée de temps en en temps ; avant chaque mesure, il est recommandé de rincer l’électrode au moyen d’eau distillée. L’électrode est combinée, réunissant dans un seul système l’électrode-test au Calomel et l’électrode de mesure en verre.

Pour terminer l’exposé de ces différentes méthodes de dosage du pouvoir lipasique, nous mentionnons encore la méthode dilatométrique, qui est

basée sur les principes se rapprochant de ceux de la méthode stalagmométrique.