CHAPITRE IV CARACTÉRISATION DE NOS LEVURES LIPOLYTIQUES

Méthodes employées :

1) Culture sur lame:

Pour contrôler le développement morphologique de nos Levures nous avons eu recours à la culture sur lame ; nous avons employé une légère modification de la technique de RIVALIER et SEYDEL (40). Une lame de verre flambée est placée en boîte de Pétri stérile sur des tubes de verre coudés servant de supports : en soulevant légèrement le couvercle de la boîte de Pétri, nous coulons à l’aide d’une pipette de Pasteur stérile, sur la lame préalablement chauffée, quelques gouttes du milieu gélosé liquéfié à la chaleur. On recourbe une pipette de Pasteur en triangle, dont la base constitue une spatule, au moyen de laquelle on étend uniformément sur la lame les quelques gouttes du milieu de culture. Dans la boîte de Pétri, le milieu, en se refroidissant, forme sur la lame une mince pellicule solide. On dispose alors quelques éléments levuriens sur cette pellicule, en deux ou trois points. On dépose dans le fond de la boîte de Pétri soit un tampon de coton imbibé d’eau stérilisée, soit 2 ou 3 ce d’eau stérilisée pour maintenir l’humidité. On porte le tout à l’étuve à 259 pendant quelques jours. Les cultures sont arrêtées et examinées dès qu'à l’œil nu, on remarque qu’elles se sont développées. On

eut fixer alors à l’Alcool et on colore avec un colorant adéquat, par exemple le Bleu de Méthylène ou le Bleu de Lactophénol, puis on déshydrate à l’Alcool absolu, à l’Alcool-Xylol et au Xylol pur. On obtient ainsi une préparation durable en plaç ant sur la culture une lamelle munie d’une goutte de Baume de Canada pour inclure la préparation.

On peut, bien entendu, également examiner ces préparations à l’état frais, sans fixation.

Nous avons utilisé pour ces recherches le milieu glycériné au jus de pomme de terre de J. MEYER. Ce substrat est préparé de la façon suivante:

1) Jus de pomme de terre ..........:.:.., 500,00 ce

Da PEDLORE Se dur «'aiatdi ele la ia on à ea ia ns ie ne 0 à à 10,0 g

Glucose EN RTE RE PEN ET 1000 Glycérophosphate de potasse .......... 05 g Sulfate de magnésie .............. Rae 0,25 g Chlorure de sodium ere ne 0,50 g Extrait, de viande Liébig "00000 2,90 g Citrate de fer ammoniacal ......... ras 0,05 g Glycérine EAP Fire iRe pitdee 30,00 g Bautorditaresq is ND. re CPE ee Te No00U00rr 5) Gélose Fee ones AA SE 6200077

Pour préparer le jus de pomme de terre, nous avons chauffé à l’autoclave à 120°, pendant une heure, 200 g de pommes de terre pelées et coupées, additionnées de 450 ce d’eau. On a ensuite trituré les pommes de terre cuites, mais encore plus ou moins consistantes, dans une capsule en présence du jus de cuisson, pour obtenir une purée fine et homogène. On laisse refroidir, puis on centrifuge pendant une heure à 4.000 toursminute environ. La solution limpide et opalescente peut être facilement décantée du dépôt grossier de pomme de terre et on complète avec de l’eau à 500 cc. Ce jus de pomme de terre est ensuite mélangé avec le bouillon glycériné glucosé (2) puis on y ajoute les 20 g de gélose gonflée et lavée préalablement (3). On replace le tout à l’autoclave pour dissoudre la gélose ; on ajuste à pH — 6,0 et on répartit selon les nécessités dans des fioles ou des tubes de culture et on stérilise à l’autoclave à 1159 pendant 30 minutes. En cas de formation de précipité, on filtre préalablement à travers une toile. On laisse refroidir dans les récipients pour employer ces milieux selon les besoins.

2) Culture en milieu au moût de bière:

Nous avons employé ce milieu en ayant recours à du moût non houblonné que nous avons introduit à raison de 100 ce dans des ballons d’Erlenmeyer de 250 ce. Le tout est stérilisé à 1100 pendant 20 minutes. Après ensemencement et culture à 24° pendant trois jours, on peut contrôler ces cultures par des prélèvements portés sur lame pour l’étude de l’aspect et de la taille des cellules.

D’après STELLING-DEKKER (41), on peut utiliser à la place du moût de bière le milieu suivant :

On triture 1 kilogramme de Malt moulu dans 2,6 litres d’eau ordinaire pour obtenir une pâte homogène que l’on dispose pendant 3 heures dans un bain-marie à 450, en agitant de temps en temps. On porte ensuite la température à 63° et on fait macérer pendant une heure encore. On filtre à travers une toile, puis on dilue au moyen d’eau pour obtenir une concentration de 15° Ballung. On ajûste ensuite à pH — 6,0, on répartit et on stérilise définitivement à 1150 pendant 20 minutes.

3) Culture en stries sur moût gélosé:

On prépare, à partir du moût de bière non houblonné, des milieux solides inclinés par addition de 2 %, de gélose ; on stérilise après répar-

2 T QPSR

tition en tubes de culture à 1159 pendant 20 minutes, puis on ensemence au moyen d’un ensemenceur en stries et on pratique la culture à 24° ; les colonies se développant sur la gélose inclinée doivent être observées pendant un mois. On a intérêt d'employer ce milieu pour l'observation des colonies géantes.

4) Culture pour le contrôle du pouvoir gélatinolytique:

On emploie un moût de bière non houblonné solidifié par addition de 10 % de gélatine. On liquéfie au bain-marie, on transvase en tubes de culture et on tyndallise à la vapeur fluente pendant 30 minutes et trois jours consécutifs. On laisse refroidir finalement en position verticale et on ensemence par piqûre. Les cultures sont placées à 249 et on contrôle le pouvoir gélatinolytique pendant 10 semaines.

Nous avons obtenu des résultats indubitables en employant un milieu gélatiné de composition suivante:

ÉD EEE ARR E rave der ed à à 20 g RO PR Tr Me ns CRT as ss 5 g Chlorure de sodium .......... LS 9 g RME PR MM RE de Lu sc Ste 100 g Eau ordinaire q. s. q. ........ see ti: O0

Préparation, stérilisation et disposition des cultures sont les mêmes

ue pour le moût gélatiné. Le contrôle du pouvoir gélatinolytique est que P £ P £ qu d’une grande importance pour la classification des germes lévuriformes.

5) Méthodes de contrôle de l'assimilation et de la fermentation des sucres:

On examine d'habitude l’assimilation et la fermentation du Glucose, Galactose, Levulose, Mannose, Saccharose, Maltose, Lactose et Raffinose. Nous avons préparé en premier lieu le milieu de base indiqué par DippENS et LODDER (42):

Sulate d'ammonIunt .--..:.....,. 5 g Phosphate monopotassique ....... Lee Sulfate de magnesium....... re 0,5 g ae AN ENS su ent en e 30,0 g LR Ma rite ti 2 D PO PEN 1.000,0 g

La gélose est d’abord lavée de la façon suivante: Couper en petits fragments 30 g de gélose et faire macérer pendant 8 jours à la température du laboratoire dans un litre d’eau distillée. Décanter l’eau, laver et rincer à plusieurs reprises la Gélose gonflée au moyen d’eau distillée fraîche. Finalement, ajouter le milieu synthétique q. s. p. 1.000 cc.

Le mélange ci-dessus indiqué est placé à l’autoclave pour pratiquer la dissolution. Filtrer et ajuster à pH — 6,0. Répartir en tubes à raison de 10 cc ; stériliser à 110° pendant 15 minutes.

Préparer d’autre part une solution vitaminée que l’on introduit à doses très faibles dans le milieu de base, afin de permettre l’amorcement de la culture des Levures à étudier. À cet effet, nous procédons de la façon suivante:

Us

Préparation de la solution concentrée de Vitamines:

Biotine 7. +7 sue share 2 Pantothénate de calcium ......... 400 y HhOSITOLRE RE Re ee Dee et 2: DURE INIACIMER. FAter one ee 400 y Acide para-aminobenzoïque ....... 200 y

Chlorhydrate de pyridoxine ........ 400 y Chlorhydrate de thiamine ........ 400 y

Ribotavinemee one > ode sde 200 y Acidefioliquentes etre EAN M AE 200 y Pau distillée 250" Gcie A: 10 ce

Tyndalliser ou stériliser par ultra-filtration à travers un ultra-filtre de Seitz. Introduire aseptiquement 10 gouttes (0,5 ce) de cette solution dans 5 ce de la solution minérale suivante:

Sulfate d’ammonium ..... Ada nets 0,5 g Phosphate monopotassique ...... 0,1 g Sulfate de Mmapnésie ="... Pre 0,05 g Chlorure de calcium er 0,01 g Chlorure de s6dim—-:... 20 2 0,01 g Eau distillée ..... PR ace ve 2 Te DUSOUÆCC

Stériliser à l’autoclave à 1200 pendant 20 minutes. Préparer 9 tubes de culture. Comme nous avons huit sucres à mettre à l’épreuve, on introduit chaque fois dans un tube 0,5 g de sucre à étudier. Le neuvième tube servira de témoin et sera dépourvu de glucide.

Ajouter ensuite dans chacun des tubes un cc de la solution vitaminée. Agiter soigneusement pour dissoudre les sucres. D’autre part, on liquéfie les milieux gélosés de base répartis en tubes à raison de 10 ce, on laisse refroidir à 45° environ ; tranvaser les solutions sucrées vitaminées dans le milieu gélosé, agiter soigneusement pour répartir les vitamines et les sucres correspondants dans les milieux de base.

Décanter les tubes dans des boîtes de Pétri préalablement stérilisées, laisser la gélose se solidifier, renverser les boîtes et les placer pendant 5 heures à 25° pour faire évaporer l’eau de condensation. -

Retourner ensuite les boîtes et ensemencer la surface du milieu gélosé au moyen de 2 ce d’une émulsion levurienne assez concentrée. Placer à l’étuve à 24° et contrôler le développement après 24 à 48 heures.

Nous avons combiné au cours de notre travail la recherche de l’assimilation des sucres et celle de la fermentation glucidique gazeuse en élaborant une technique analogue à celle que l’on utilise d'habitude pour la Colimétrie bactériologique. |

Nous avons introduit 15 ce de milieu synthétique vitaminé liquide dans des tubes de culture de 22 mm de diamètre munis d’un tube à hémolyse renversé, qui se remplit automatiquement par la stérilisation à l’autoclave et tient lieu de cloche à gaz (tube de Besson). D’autre part, nous avons introduit comme indicateur de pH pour contrôler l’acidification du milieu par l’assimilation du sucre en étude, du Bromocrésolpourpre, qui vire à pH — 5,6 du pourpre vers le jaune.

La levure acidifie le milieu en dégradant le sucre à un pH plus acide que 5,6 ; dans ce cas, le milieu initialement pourpre vire au jaune. Si cette assimilation est accompagnée d’une fermentation gazeuse, le petit tube à hémolyse se remplit de gaz et concrétise cette formation.

Notre milieu avait la composition suivante :

Milieu synthétique minéral (*) ...... 15 cc Solution concentrée de Vitamines ... 1.5 ce Solution de Bromocrésol-pourpre .... 0,3 ce

Le milieu doit être ajusté à pH — 6.0 et présenter une teinte pourprée. La solution de Bromocrésol-pourpre se prépare de la façon suivante :

Dissoudre: Bromocrésol pourpre ............. 0,1 g

dans : Éanucdstillée 2, a) tonte Li 0 cc En LEE DEAN CRE ET ess Pres 3,7 ce

Chauffer pour dissoudre et compléter à 500 cc au moyen d’eau distillée stérile. :

Cette méthode permet ainsi de contrôler l'assimilation d’un sucre par une Levure, étant donné l’acidification du milieu et, par là, le virage au jaune ; puis la formation de gaz consécutive à la fermentation glucidique par la Levure, au moyen du tube de Besson.

Méthode de contrôle de l'assimilation des Nitrates:

Nous avons emplové pour ces recherches le milieu minéral indiqué antérieurement. Puis on ajoute, comme source glucidique: Glucose 20 g et le milieu minéral vitaminé, ne contenant comme source azotée que soit du Nitrate de potassium : 0,78 g, soit du Sulfate d’ammonium : 1,10 g. Le milieu de base est préalablement stérilisé à 1100 pendant 15 minutes.

Comme milieu-test, on emploie le même substrat dépourvu d’Azote minéral, qui est remplacé par la Peptone. Ce milieu définitivement constitué est coulé en boîtes de Pétri et ensemencé avec une émulsion de la souche levurienne en expérience. On place la culture à 249 et on lit le résultat après 1 à 2 jours d'observation.

Recherche sur l’utilisation de l'alcool comme source hydrocarbonée unique :

Le milieu de base pour cette recherche est toujours le même:

Sulfate d’ammonium ............ 1,10 g Phosphate monopotassique ...... 1,00 g Sulfate de magnésie ............ 0,50 g PAREIL NAS 4 1.000,00 g

On répartit en tubes et on stérilise à 1209 pendant 15 minutes. Après refroidissement, on introduit 1 goutte de la solution minérale vitaminée, ‘puis on ajoute 3 % d’Alcool.

On voit que ce milieu ne contient, en dehors de l’ Alcool, aucune sub-

(*) Le milieu minéral vitaminé peut être acheté dans le commerce au Laboratoire DIFCO, à Détroit, U.S.A., sous le nom de « Yeast Nitrogen Base».

REY ns

stance hydro-carbonée. On prépare un tube-témoin sans Alcool et on ensemence au moyen d’une émulsion de la souche levurienne en expérience; on place à l’étuve à 24° et on lit le résultat du développement après 4-8 et 21 jours.

Contrôle de la dégradation de l’Arbutine:

On prépare le milieu suivant:

ATDUUNESN eee le 5,0 g Géloselavéelet/ponflée 20,0 g Décoctronsdeslevures "rFPECrEErEEE 1.000,0 g

On stérilise à 1200 pendant 15 minutes. On prépare d’autre part, des boîtes de Pétri stérilisées dans lesquelles on introduit une goutte de solution de Perchlorure de fer, puis on coule dans ces boîtes le milieu gélosé à l’Arbutine, pour obtenir une couche mince dans le fond de la boîte de Pétri. On mélange soigneusement pour bien répartir le Perchlorure de fer dans le milieu gélosé encore liquide. On laisse solidifier et on ensemence avec une émulsion de la souche levurienne en expérience. On place à 25° et on lit les résultats après 2-3 et 6 jours. La dégradation de l’Arbutine se manifeste par l’apparition d’une zone brun-foncé autour des colonies.

Contrôle de la formation de substances amylacées :

Pour ces recherches on a recours au milieu synthétique suivant:

Sulfate d’ammonium .:........... L08S Phosphate monopotassique ....... 1,0 g SUIFATE de MAPNEN EME NN ER 0,5 g Glucose RER ARTE RE ER 10,0 g Gélosetgontléelet lavé eee et 25,0 g Eau dstilléene ee RM ere 1.000,0 g

On effectue la dissolution, puis on ajuste le pH à environ 4,5 au moyen d’Acide chlorhydrique dilué. On répartit en tubes, on stérilise à 1100 pendant 15 minutes. On ajoute finalement une trace du milieu minéral vitaminé indiqué antérieurement pour la recherche de l’assimilation des sucres. Au moment de l’emploi, on coule en boîtes de Pétri préalablement stérilisées et on ensemence comme d’habitude. On place à l’étuve à 240 et on effectue le contrôle de la formation de substances à base d’Amidon en introduisant, après une ou deux semaines de culture, à la surface du milieu gélosé, quelques gouttes d’une solution iodo-iodurée de Lugol. L'apparition d’une teinte bleuâtre ou violette indique un résultat positif.

Contrôle des caractères biochimiques en milieu de Lait tournesolé:

On introduit dans des tubes de culture 10 ce de Lait dégraissé et l’on tyndallise pendant 3 jours successifs par chauffage à 100° pendant 30 minutes. On ajoute ensuite 1 cc d’une Teinture de Tournesol stérile

ER, de

à 1% et, éventuellement, L ce d’une solution stérile de Lactate de calcium à 5 %. Pour chaque expérience on ensemence des tubes de Lait tournesolé avec et sans Lactate de calcium et on les place à l’étuve à 249, On effectue la lecture des résultats après 2 à 4 semaines.

Contrôle du pouvoir lipolytique :

Nous donnons ci-dessous, à ce sujet. la technique de ErJKMAN:

On fait fondre de la graisse de bœuf brute, puis on filtre et stérilise. On introduit ensuite environ 0.5 ce de cette graisse fondue dans le fond de boîtes de Pétri préalablement stérilisées et encore chaudes. La couche de graisse doit être très mince et bien répartie sur le fond de la boîte : si l’on introduisait un excès de graisse, il faudrait le retirer au moyen d'une pipette chauffée. On laisse ensuite s’opérer la solidification, en plaçant les boîtes pendant 2 heures à la glacière. On introduit . alors de la Gélose de Gorodkowa. décrite antérieurement, chauffée et refroidie à 40° environ. et additionnée de Carbonate de calcium au taux de 0,1 %. Cette manipulation doit être effectuée avec beaucoup de soin, pour éviter d'endommager la couche de graisse. On ensemence comme d'habitude et on effectue la culture à 240, Le pouvoir lipolytique se manifeste d'habitude après quelques jours par l’apparition d’une teinte crayeuse au-dessous du milieu de culture au contact de la couche de graisse. Ce phénomène est dû à la formation de Sels de calcium d’Acides gras. Si on travaille avec une Eau calcaire, comme c'était notre cas, l’addition de Carbonate de calcium devient inutile.

Nous avons ainsi décrit les méthodes de laboratoire facilement réalisables, qui nous ont servi pour contrôler les propriétés biochimiques et biologiques des organismes levuriens qui nous ont intéressé directement dans notre travail.

Étude des Levures lipolytiques :

Pour nos recherches concernant les Levures lipolytiques, nous avions à notre disposition deux organismes de caractères nettement connus : Candida lipolytica et Trichosporon pullulans. Comme il ressort du Chapitre I, ces deux micro-organismes sont des Levures asporogènes et font ainsi partie de la famille des Cryptococcacées ; on n’a jusqu'à présent pas pu observer chez ces deux Levures une reproduction sexuée soit par ascospores, soit par ballistospores et il s’agit par conséquent de Champignons imparfaits ou de germes imparfaitement connus. Cependant, malgré que ces deux Levures font partie de la même famille des Cryptococcacées, elles ont des caractères morphologiques et biochimiques bien différents, et la première est rangée dans la tribu des Candidées, tandis que la seconde se trouve dans la sous-famille des Trichosporoïdées.

Avant d’exposer nos recherches concernant le pouvoir lipolytique de ces deux germes levuriformes, nous voudrions encore mentionner une méthode qualitative pour le dosage de celui-ci. Il s’agit de la méthode de Berry (43). D’après cette technique, on introduit dans des boîtes de

Rio

Pétri un milieu gélosé contenant du Beurre, de l’Huile de coton ou de l’Huile de soja. On ensemence les micro-organismes à examiner en exposant pendant 3 jours ou plus à 240. On traite ensuite le milieu gélosé lipidique pendant 10 minutes au moyen d’une solution saturée de Sulfate de cuivre. La formation de taches bleues verdâtres dues à des savons de cuivre indique le pouvoir lipolytique des organismes en expérience.

Ceci dit, passons à la description de nos deux Levures lipolytiques et à celle des recherches que nous avons dû effectuer pour contrôler l’identité de ces germes.

Candida lipolytica :

Cet organisme a été décrit sous différents noms ; nous indiquons ci- * dessous les divers synonymes:

Torula lipolytica, nom. nud.

Mycotorula lipolytica, HARRISON (44)

Monilia cornealis, NANN1IZZ1 (45)

Proteomyces cornealis, Dopce (46) Pseudomonilia deformans, WoLFRAM et ZACH (47) Candida deformans, LANGERON et GUERRA (48) Candida olea, VAN RiJ et VERONA (49)

Description classique de l’organisme:

Cette Levure a été isolée pour la première fois en 1921 à partir d’une Margarine altérée. Elle a été ensuite étudiée par JACOBSON qui lui a donné le nom de Torula lipolytica, puisqu'il a découvert à ce moment son pouvoir lipolytique. Cet auteur n’a cependant jamais publié de description détaillée et c’est la raison pour laquelle la dénomination de Torula lipolytica créée par l’auteur constitue un nomen nudum. HARRISON qui a ensuite étudié les caractères culturaux et morphologiques de cette espèce a pu constater qu'elle était capable de former des éléments mycéliens vrais et l’a désignée pour cette raison par le terme Mycotorula. Il donne la description suivante: « En moût de bière ou sur moût gélosé, on trouve des cellules elliptiques ou cylindriques de taille variable. Les cellules elliptiques peuvent mesurer 1,6 X 3,3 à jusqu’à 2,5 X 6,6 u. Les cellules cylindriques ont en général un diamètre de 1,6 y et une longueur de 6,6 à 20 1. Dans des cultures plus âgées, les cellules elliptiques mesurent d’habitude 3,4 à 4,2 u. Les filaments mycéliens peuvent être munis de bourgeons latéraux allongés et elliptiques. L’aspect macroscopique de la culture en moût de bière montre la formation d’un anneau ou d’une pellicule chétive. Plus tard, il se forme un dépôt important au fond du tube. Sur moût gélosé, les colonies sont ternes, blanchâtres et rugueuses ; plus tard, même plus ou moins plissées. La liquéfaction du moût gélatiné débute vers le 3° jour et devient complète après 24 jours. L’assimilation des glucides s’effectue sans production

Pr AU.

de gaz. Le lait est coagulé et complètement peptonisé avec formation d’un voile à la surface. »

Dans leur important ouvrage DIDDENS et LODDER ont classé cet organisme sous le nom de Candida lipolytica eu égard à sa propriété de former du pseudomycelium. Ces auteurs ont examiné 4 souches différentes et donnent la définition suivante de cette espèce:

« Développement abondant de pseudomycelium et de mycelium vrai. Formation de blastospores rares, soit groupeés en petits verticiles ou en chaïînettes courtes, pleurales ou terminales, qui peuvent prendre un aspect arborescent. Les cellules en moût de bière sont le plus souvent longuement ovalaires et quelquefois même allongées ; de rares cellules seulement sont sphériques ou faiblement ovalaires. La taille peut varier grandement : de 2 à 4,5 X 4 à 221. En moût de bière, dépôt abondant et au début apparition d’une pellicule chétive qui, en vieillissant, devient coriace et épaisse. Les cultures en stries sur moût gélosé sont jaunâtres, molles, brillantes et rugueuses et sur toute la surface plus ou moins plissées. Pas de développement de gaz en milieu synthétique sucré : croissance en présence de Glucose, de Levulose et de Mannose. Les combinaisons azotées suivantes sont assimilées: Sulfate d’ammonium, Asparagine, Urée et Peptone. L’Alcool éthylique comme unique substrat glucidique donne un développement chétif (pellicule mince) ou nul. Liquéfaction de la gélatine rapide et complète. Peptonisation du lait tournesolé : dégradation de l’ Arbutine néant ou très faiblement positive ; pouvoir lipolytique positif. »

Plus récemment, LopDER et KREGER-Van RiJ ont étudié, en plus des espèces déjà contrôlées par DIDDENS et LODDER, huit autres souches. Leurs observations confirment les résultats ci-dessus indiqués. D’autre part, ces auteurs ont pu identifier l'espèce décrite par Van Ri1J et VERONA sous le nom de Candida olea avec Candida lipolytica.

Recherches d'identification personnelles :

Culture sur lame:

Nous constatons la formation d’un pseudo-mycelium abondant et de mycelium vrai moins riche, caractérisé par des filaments cloisonnés. Les blastospores, plutôt rares, se trouvent insérées le long du mycelium sous forme de courtes chaînettes (fig. n° 3).

Culture en moût de bière:

Après 3 jours de culture à 24°, la plupart des cellules sont longues et ovales ou allongeés ; on trouve cependant quelques cellules sphériques ou légèrement ovalaires. La taille des cellules varie beaucoup et se trouve à peu près dans les limites suivantes: 2 à 5 p sur 2,5 à 19 4 (fig. n° 4). L'examen macroscopique montre un anneau blanchâtre, grimpant le long des parois. Il y a ensuite formation d’une pellicule mince à la surface du milieu et au fond un dépôt floconneux. Après un mois, on note

AT La

un voile épais et coriace, qui tombe au fond des tubes à la moindre agitation, formant ainsi un dépôt abondant.

Sur moût de bière gélosé, les colonies sont brillantes, molles et crémeuses ; au bout d’un mois à 249, elles sont plus ou moins plissées et granuleuses sur toute la surface.

Liquéfaction de la gélatine:

La liquéfaction de la gélatine est complète. Après une semaine de culture, la liquéfaction est déjà nettement positive et s’effectue en entonnoir.

Fermentation gazeuse:

Nous avons examiné 6 sucres dont aucun n’a été dégradé avec formation de gaz.

Assimilation des sucres:

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