CHAPITRE V

ESSAI D’ISOLEMENT DES LIPASES LEVURIENNES DANS LES SOLUTIONS CULTURALES

Dans le chapitre suivant nous essayerons d’étudier le pouvoir lipolytique de nos deux organismes levuriformes: Candida lipolytica et Trichosporon pullulans, que nous avons analysé au point de vue purement cryptogamique dans le chapitre IV, au cours duquel nous avons vu qu’ils sont caractérisés par cette propriété spécifique.

On connaît en effet cette action enzymatique de ces Levures depuis fort longtemps, mais on n’a Jamais essayé d'isoler et d’étudier leur enzyme lipasique même. Il nous intéressait surtout de comparer ces Lipases levuriennes avec celles isolées des Bactéries acido-alcoolo-résistantes et qui ont fait l’objet de travaux antérieurs dans le Laboratoire de Microbiologie de la Faculté de Pharmacie de Strasbourg.

Dosage des Lipases levuriennes par la méthode ionométrique:

Nous avons déjà relaté dans le chapitre III des différentes méthodes employées pour le dosage quantitatif des actions lipasiques. Nous pouvons onc à présent nous limiter à donner les détails de la méthode électrométrique ou ionométrique que nous avons utilisée au cours de nos recherches.

Pour l’élaboration de notre technique, nous nous sommes surtout basé sur les travaux antérieurs de ScHÂR et MARTI, qui ont employé également cette méthode et qui ont étudié sa valeur expérimentale par rapport aux autres techniques anciennement utilisées. Ces auteurs sont partis de la méthode alcalimétrique de WILLSTAETTER et de ses élèves et de sa modification de VOGEL et LAEVERENZ (57). ScHÂR et MARTI ont expérimenté l'influence des différentes solutions-tampon et d’activateurs sur les résultats qualitatifs et quantitatifs de la méthode ionométrique. Ils ont travaillé non seulement avec les Lipases bactériennes, mais également avec des Extraits pancréatiques. ScHÂR a étendu ses dosages jusqu’à 48 heures et plus pour contrôler d’une façon rigoureuse l’effet des tampons et des activateurs sur ces Lipases. MARTI, par contre, a restreint ce temps d'interaction entre l’enzyme et les substrats; ce fait a non seulement simplifié la méthode, mais également amené des conditions expérimentales plus homogènes. Nous avons donc surtout employé cette méthode de MARTI que nous avons dû modifier légèrement pour l’adapter à nos besoins résultant de l’emploi des Levures. Nous

ui 49 21 pouvons donner la technique générale utilisée par nous, de la façon suivante :

Technique générale:

Nous avons introduit dans un flacon de 30 ec à large ouverture bouché à l’émeri, les produits suivants dans l’ordre indiqué ci-dessous :

Solution lipolytique à examiner ............... 10 ce DOME ERA A 0 li sacs sauteuse 2 ce Solution d’Oléate de soude à 2% ............ PAL Solution de Chlorure de calcium à 2% ....... 2 cc Huile d'olive neutre .......... ES CP TEE 3 cc

Les solutions d’Albumine, d'Oléate de soude et de Chlorure de calcium constituent les activateurs de l’action lipasique. Au cours des manipulations, il importe donc d'introduire ces différents composants dans l’ordre numérique indiqué ci-dessus, ceci surtout pour réaliser, par la formation d'Oléate de calcium, une émulsion caractéristique et stable dûe à cet activateur.

Après avoir ajusté le mélange réactionnel à un pH entre 8,5 à 9.0, l'Huile d'olive peut être hydrolysée par les Lipases avec formation d’Acides gras libres (principalement Acide oléique), et de Glycérine. Ces Acides gras libérés de cette façon occassionnent une modification de la réaction ionique du mélange en expérience, phénomène qui peut être mesuré par le déplacement du pH vers la zone acide. Cette variation peut être mesurée au moyen de notre pH-Mètre et on peut ramener, au moyen d’une solution de NaOH N/10, la concentration ionique vers son taux initial. En additionnant les centimètres cubes de NaOH N/10 nécessaires pour ramener au pH initial, on peut déterminer le taux d’Acides gras libérés par l’action lipasique. Il existe, en effet, un rapport direct entre les Acides gras libérés et la dose d’Huile d’Olive qui a été décomposée par l’action enzymatique, de sorte que le taux de NaOH N/10 nécessaire pour ramener à la concentration ionique initiale exprime directement la force du pouvoir lipasique.

Pratiquement, nous avons effectué nos dosages au moyen de notre pH-Mètre de la façon suivante:

1) Détermination du pH de la solution lipasique à examiner.

2) Détermination du pH de l’ensemble du mélange en expérience.

3) Ajustement au moyen de NaOH N/10 au pH — 8,5 à 9,0. On a cependant avantage à utiliser dans ce cas une solution de NaOH N, puisqu'on évite ainsi une augmentation du volume total du mélange en expérience; ceci surtout puisque cette dose initiale de NaOH ne joue pas pour le résultat final.

4) Agitation pendant 30 minutes du mélange réactionnel, à la température du laboratoire, puis séjour à l’étuve à 370 pendant une heure. Nouvelle agitation pendant 30 minutes.

Replacer à l’étuve à 37° pendant une heure.

Nouvelle agitation pendant 30 minutes à la température du laboratoire.

tte

On effectue ainsi les dosages de l’action enzymatique sur une durée totale de 3 heures 14.

5) Mesure de la différence de pH et réajustement au pH initial, au

moyen de NaOH N/10 (pH entre 8,5 à 9,0).

6) Répétition des manipulations indiquées sous 4). La durée du temps de réaction est encore de 3 heures 1.

7) Nouvelle détermination de la différence du pH et réajustement

vers le pH initial au moyen de NaOH N/10.

8) Calcul de la somme totale de NaOH N/10 utilisée au cours de ces deux temps de réaction [5 et 7]; celle-ci exprimée en cc donne le taux du pouvoir lipasique du substrat en expérience.

Remarque supplémentaire: Si le substrat lipasique n’a pas été stabilisé préalablement par addition de Toluène, il faut ajouter au mélange en réaction encore 5 gouttes de Toluène pour assurer sa stérilité au cours de l’expérience.

D’après MARTI et d’autres auteurs, cet antiseptique n’a aucune action frénatrice sur les Lipases.

La solution d’Albumine a été fraîchement préparée pour chaque série de réactions.

Pour l’agitation, nous nous sommes servi d’un agitateur électrique réglé à 180 mouvements par minute. Comme substrat lipidique, nous avons eu recours à l’Huile d’olive pure et neutralisée (Oleum olivae neutralisatum purissimum, Siegfried A. S. Zofingue, Suisse).

Dosage des Lipases à partir des liquides culturaux:

Pour obtenir ces liquides, nous avons préparé des cultures de Candida lipolytica et de Trichosporon pullulans en introduisant le milieu nutritif à raison de 50 cc dans des fioles de Fourneau de 200 cc. Comme milieu nous avons employé le jus de pomme de terre glycériné à 3 % de J. MEYER décrit dans le chapitre IV. Dans une autre série d’expériences, nous avons eu recours au même milieu mais contenant 10 % de Glycérine au lieu de 3 %, dans l'espoir de pouvoir éventuellement augmenter la dose de Lipases dans le milieu ambiant. Les cultures sont disposées à l’étuve à 24° pendant 1, 2, 3 ou 4 semaines. Après ce temps respectif, les cultures ont été additionnées de 20 ce de Toluène. On agite fortement et on laisse reposer pendant 3 jours à la température du laboratoire. On centrifuge ensuite le contenu de la fiole de Fourneau pendant 15 minutes pour séparer les éléments cellulaires et mycéliens du liquide culturel. Cette manipulation ne permettait pas d’obtenir une séparation nette, étant donné qu’une grande partie du mycélium se localisait dans la zone de séparation entre le Toluène et le liquide cultural. Pour cette raison, nous avons prélevé, au moyen d’une pipette graduée, 10 ec exactement mesurés du liquide cultural, en renonçant ainsi à l’emploi . de la totalité de ce substrat. Les 10 ce de liquide cultural limpide ont

alors été employés pour le dosage du pouvoir lipolytique en suivant les prescriptions données ci-dessus.

Chaque série d'expérience comportait en plus un témoin, c’est-à-dire un milieu de culture stérile non ensemencé. soumis au mêmes manipulations que les liquides culturaux mêmes. Ce test nous a permis de déterminer le taux de NaOH incombant au milieu proprement dit.

Nous avons complété cette expérience en utilisant dans une autre série de culture à la place de l'Huile d'Olive de la Tributyrine.

Les résultats obtenus au cours de ces recherches sont exprimés dans les tableaux 3 à 10.

TABLEAU No 3

Cultures en jus de pommes de terre glycériné à 3 %.. Dosage des lipases dans les solutions culturales âgées de 1 semaine avec de l'huile d'olive.

Candida lipolyt. Trichosporon pull.