CHAPITRE VI

ESSAI D’ISOLEMENT ET DE DOSAGE DES LIPASES A PARTIR DU MYCÉLIUM LEVURIEN

1) Essai de dissolution de la Lipase levurienne:

Emploi d’une solution hypertonique de Chlorure de sodium:

D’après les résultats que nous avons obtenus dans le chapitre précédent, il semble que les Lipases levuriennes ne sont pas solubles dans un substrat aqueux isotonique. C’est pour cette raison que nous avons jugé nécessaire d’examiner les résidus cellulaires et mycéliens des cultures récoltés après centrifugation et décantation du liquide cultural. Nous nous sommes donc posé le problème: comment isoler ces Lipases contenues dans les cellules levuriennes ?

Nous avons essayé de résoudre cette question de différentes manières. Une des méthodes les plus adéquates nous semblait d’essayer de libérer ces Lipases par plasmolyse des cellules levuriennes en appliquant le principe établi par SARTORY et MEYER (58) pour la préparation des lysatvaccins. À ce sujet, nous avons réalisé des cultures de nos organismes en milieu de jus de pommes de terre glycériné. Pour améliorer le rendement, nous avons modifié la composition de ce milieu en augmentant le taux du Glucose de 0,5 à 1 %. Notre supposition à ce point de vue s’est avérée exacte.

Les cultures disposées à 240 ont été interrompues après 1, 2, 3 et 4 semaines par addition de Toluène dans les proportions de 10 % sur le volume total. On agite soigneusement et on laisse reposer pendant 24 heures. Après ce laps de temps, nous avons séparé la récolte levurienne du milieu de culture par filtration au moyen d’un entonnoir de Büchner. Finalement, nous avons lavé les résidus cellulaires sur le filtre au moyen d’eau distillée jusqu’à ce qu’elle s’écoule incolore. Le résidu mycélien, qui était protégé contre une surinfection par les larges traces de Toluène résiduelles, a été ensuite traité avec une solution hypertonique de Chlorure de sodium à 20 %. Le rapport entre cette solution et le poids du mycélium traité était de 12. Le tout a été soigneusement trituré et placé à l’étuve à 370 pendant 48 heures. Nous avons ensuite filtré sur entonnoir de Büchner pour récolter le filtrat, qui devait nous servir à la caractérisation éventuelle de la Lipase levurienne au moyen de la méthode ionométrique et d’Huile d'olive comme substrat. La méthode employée a été celle décrite dans le chapitre V ; nous avons utilisé 10 ec de filtrat directement et dans une deuxième série 10 ce du même filtrat ont été

TTC

dilués par 5 ce d’eau distillée. Le dosage a été effectué sur ce filtrat dilué pour éviter éventuellement une influence nuisible de la forte concentration saline de notre filtrat.

Chaque série d'expériences a été encore complétée par un témoin au moyen d’une solution de Chlorure de sodium au même titre, mais n'ayant pas été en contact avec les Champignons.

Résultats :

Nous jugeons inutile de rédiger les résultats obtenus dans un tableau, étant donné que, pratiquement, les concentrations en ions H n’ont guère varié, ce qui signifie soit que la plasmolyse n’ait pas permis de solubiliser la Lipase levurienne, soit que les fortes concentrations de Chlorure de sodium l'aient détruite.

Essai de solubilisation de la Lipase levurienne dans la Glycérine:

Partant de la conception d’auteurs antérieurs en particulier de Tammisro (59) sur la grande solubilité de la Lipase pancréatique dans la Glycérine, nous avons essayé d’épuiser au moyen de ce solvant notre Lipase levurienne. Nous avons employé tout d’abord un mélange de quatre parties de Glycérine et de 6 parties d’eau.

Pour ces expériences, nous avons tout d’abord traité le résidu cellulaire levurien au moyen d’une solution hypertonique de Chlorure de sodium, comme nous l’avons décrit ci-dessus. Cette masse mycélienne a été soigneusement lavée au moyen d’eau distillée et ensuite passée à travers un micro-broyeur pour réaliser une destruction aussi complète que possible des cellules. Nous avons pensé, de cette façon, pouvoir réaliser un contact plus intime entre la Lipase et le solvant glycériné. Le résidu mycélien ainsi obtenu a été étalé sur une assiette d’argile poreuse et porté à 309 pour obtenir une déshydratation aussi poussée que possible. La masse était ensuite pulvérisée et encore une fois desséchée.

Nous avons alors prélevé 1 g de cette poudre mycélienne déshydratée et nous l’avons triturée avec 12 ce de la solution hydroglycérinée à 40 %,, en ajoutant 5 gouttes de Toluène. L’émulsion ainsi obtenue est introduite dans un flacon de 30 cc à large ouverture, bouché à l’émeri. Pour activer la dissolution, ces mélanges ont été agités mécaniquement pendant 1% heure, puis on laisse reposer pendant 2 heures et on répète les mêmes manipulations encore à deux reprises. Finalement, nous avons laissé macérer le tout pendant une nuit, et agité ensuite encore pendant 30 minutes. Le contenu du flacon est transvasé pour être centrifugé. On décante le liquide surnageant, en le passant sur une toile. Les résidus mycéliens réunis ont été repris encore au moyen de 5 ce de la solution hydro-glycérinée ; nous pratiquons une agitation soigneuse, nous centrifugeons et le liquide surnageant est réuni après filtration sur gaze, au premier filtrat. Nous avons employé 10 ce de cet extrait glycéroaqueux pour la recherche et le dosage éventuel des Lipases. La méthode employée était encore celle décrite dans le chapitre V et le substrat lipi-

FASO

dique était l’Huile d’Olive. Comme témoin nous avons eu recours à 10 cc de liquide glycéro-aqueux, n’ayant pas été en contact avec les Levures.

Résultats:

Les extraits glycérinés ainsi préparés étaient également dépourvus d’action lipasique, puisque nous n’avons pas pu constater de modifications sensibles de la concentration ionique entre les solutions témoins et les extraits hydro-glycérinés.

Essai de solubilisation des Lipases levuriennes dans le Sirop simple:

ManrTi a déjà essayé de mettre en solution des Lipases bactériennes dans du Sirop simple. Nous avons repris ses essais, au moyen de nos Levures, pour essayer d'isoler les Lipases levuriennes dans une solution sucrée à 60 %. Pour réaliser cette expérience, nous avons encore employé la même technique décrite ci-dessus pour l’extrait hydro-glycériné.

Résultats:

Ici également, les extraits au Sirop simple ne nous ont pas montré d’action lipasique par l’emploi de Lessive de soude en quantité sensiblement plus forte que les témoins. Nous nous croyons donc en droit de conclure que les Lipases levuriennes sont insolubles dans le Sirop simple dans ces conditions expérimentales.

Essai de dosage des Lipases fixées sur les éléments levuriens mêmes:

Etant donné l’impossibilité d'isoler les Lipases pour les mettre en solution au moyen des différentes méthodes que nous avons utilisées, nous avons jugé nécessaire de rechercher et de doser éventuellement ces Lipases directement dans le mycélium levurien. Nous avons employé à ce sujet le résidu cellulaire provenant de cultures sur jus de pomme de terre glycériné, qui a été lavé dans des solutions glycérinées à 3 %.. Nous avons déshydraté ce mycélium levurien autant que possible, pour l’em-

ployer ensuite au dosage ionométrique. Le mélange réactionnel avait la composition suivante:

Éléments levuriens déshydrate PERS 5 102 Éaurdisti) ÉCRAN RE ANA 8,0 g Solution 2 d'AlDAREN ENS SP TERRE RER 2,0 g Solution d’Oléate de soude à 2% ........ A ULE Solution ‘de Chlorure de Calcium 2%. 2,0 g Huile d'olive neutre .......... he nee 3,0 g Toluène RES M ANA SE A see scoot DC POULLES

Quant aux manipulations et à la marche de l’analyse, nous renvoyons au chapitre V. à

50 ei

Nous avons employé simultanément un mélange témoin sans addition d'Huile d'Olive, afin de pouvoir contrôler la quantité de NaOH N/10 propre à ce mélange.

D'autre part, nous avons remplacé, dans une nouvelle série d’expériences, l’Huile d'olive par la Tributyrine. Toutes les autres conditions expérimentales ont été maintenues.

Nous donnons dans les tableaux n° 11 et 12 les résultats de ces analyses. Pour plus de clarté, nous avons renoncé à inscrire dans ce tableau les valeurs de pH que nous avons mesurées, nous contentons d'indiquer la somme des doses de NaOH N/10 employées pour réajuster chaque fois la concentration ionique à son pH initial de 8,5 à 9,0.

Pour la même raison nous avons exprimé ces résultats seulement par les moyennes calculées de chaque fois trois séries d'expériences analogues. Notons encore que nos dosages se sont étendus sur une durée de

- 7 heures.

TABLEAU No 11

Dosage des Lipases à partir de 1 g de mycélium levurien déshydraté, au moyen d'Huile d'olive.

cc NaOH N/10

TABLEAU No 12

Dosage des Lipases à partir de 1 g de mycélium levurien déshydraté, au moyen de Tributyrine.

cc NaON N/10

Age des cultures Candida lipolytica Trichosporon pullulans

Essai |Témoin Différ. | Essai | Témoin | Difér.

127 semaine........... 1200100087 0,39 3,38 2 TSI AR 2UBEMAME. A+ Sert 1,98 | 1,50 0,48 3,43 2,300 mL TS de semaines ue ra TD'IGRHOEL 52 0,44 3.21 228 1020:98 AS SHARE Que canvros 1,88 | 1,45 0,43 3,52 2,21 | 1,14

Interprétation:

En considérant ces résultats, on voit que les deux mycéliums levuriens déshydratés possèdent indubitablement un pouvoir lipasique ; on constate d’autre part, que le Trichosporon pullulans est muni d’une Lipase plus active que Candida lipolytica. En examinant les résultats en rapport

er pie

avec l’âge des cultures, on note que les cultures âgées de 2 semaines possèdent le pouvoir lipolytique optimum, ceci pour les deux Levures. En vieillissant, cette action enzymatique diminue progressivement. Quant à l’expérimentation concernant la spécificité des substrats réactifs, l’Huile d'olive a été proportionnellement beaucoup plus dégradée que la Tributyrine et constitue donc le réactif de choix pour doser ces Lipases.

Il est intéressant de mentionner les résultats que nous avons pu obténir dans les séries témoins effectuées sans présence d’Huile d’olive. On constate dans ces essais également qu’il faut au début une grande quantité de Soude pour ramener chaque fois la concentration ionique à son pH initial. On peut se demander les causes de ce phénomène? Il doit s’agir d’une décomposition autolytique avec formation d’Acides libres. Nous nous sommes posé la question, si cette formation d’Acides libres ne serait pas le résultat d’une action lipasique sur les Lipides estérifiés idiogènes de nos cellules levuriennes. Cette supposition est étayée par le fait que les résultats des expériences avec l’Huile d’olive et sans celle-ci évoluent dans un sens sensiblement proportionnel. Si cette hypothèse se confirmait, on se rend compte de la difficulté de doser d’une façon rigoureuse le pouvoir lipolytique de ces substrats levuriens dont les Lipases n’ont pu être obtenues à l’état isolé et de pureté.

Nous aurons l’occasion de revenir sur ce sujet ultérieurement.

Action lipasique sur les lipides iodogènes :

Nous venons d’énoncer l'hypothèse selon laquelle les Lipases pourraient, dans un milieu approprié et ajusté à pH — 8,5 à 9,0, dégrader les Lipides propres des cellules levuriennes. Pour réaliser un dosage exact des Lipases fixées directement sur les éléments cellulaires, il faudrait essayer soit d’épuiser les substances lipidiques idiogènes des cellules avant le dosage, soit de les transformer dans les combinaisons non attaquables par ces Lipases. Nous avons essayé de résoudre le problème par ces deux moyens ; en premier lieu nous avons tenté d’éliminer les substances lipidiques par macération dans des solvants appropriés.

En nous rapportant à une publication de ALBERT, BUCHNER et Rapp (60) pour La fabrication d’une Levure de conservation, nous avons traité le mycélium levurien déshydraté et préparé comme nous l’avons indiqué au début de ce chapitre, d’après la technique suivante:

Dans un flacon de 50 ce à large ouverture, bouché à l’émeri, 3 g de mycélium déshydraté ont été macérés dans 15 cc d’Acétone et le tout agité mécaniquement pendant 10 minutes. La macération a été ensuite portée sur un petit filtre de Iéna et le solvant a été filtré par aspiration aussi rapidement que possible. On répète ensuite l’épuisement acétonique par une nouvelle agitation pendant 10 minutes. On sépare le solvant de la même façon ; le résidu sur le filtre est repris avec 10 ce d’Ether et agité pendant 3 minutes. On procède à la séparation de l’Ether ; on lave une seconde fois à l’aide de 20 ce d’Ether et on dessèche finalement à la température du laboratoire. Nous avons tenu à effectuer

PRIT 4 Res

ces manipulations aussi rapidement que possible en sauvegardant surtout les temps de macération.

Le résidu levurien ainsi obtenu a été finement pulvérisé et nous avons utilisé 1 g chaque fois pour rechercher et doser éventuellement les Lipases. Les manipulations et la marche de l'expérience ont été celles indiquées au début de ce chapitre.

Nous avons chaque fois utilisé un témoin, en employant la même suspension cellulaire, mais sans Huile d'olive. Nous exprimons dans les tableaux 13 et 14 les résultats ainsi obtenus. Chaque série d'expériences a été complétée par une série supplémentaire témoin, renfermant les résidus levuriens naturels non soumis au traitement acétono-éthéré.

Dans une autre série d'expérience, nous avons tenté d’hydrolyser les lipides levuriens idiogènes avant le dosage du pouvoir lipasique proprement dit. À cet effet, nous avons encore eu recours à 1 g de mycélium déshydraté, que nous avons introduit dans le mélange habituel d’activateurs et de catalyseurs des dosages lipasiques, sans addition d’Huile d'olive. La suspension a été ajusté à pH — 8,5 à 9,0. Ces mélanges sont agités pendant 30 minutes, ensuite portés pendant 2 heures à 370 ; on répète l’agitation encore pendant 30 minutes pour mesurer le pH et rajuster si c'est nécessaire à la concentration ionique initiale. Pour effectuer nos expériences, nous avons chaque fois eu recours à une solution de NaOH N afin d'éviter l’augmentation inutile du volume de liquide en expérience.

Nous avons continué ces manipulations dans l’ordre indiqué pendant 2 jours et les essais ont été disposés à 37° pendant la nuit. Après ce laps de temps, les pH étaient sensiblement stabilisés au moins pendant une durée de 7 à 10 heures, suivant nos contrôles.

Deux mélanges réactionnels de même origine et de composition identique ont chaque fois été mis en expérience en introduisant dans l’un 3 ce d’'Huile d'Olive neutre et en utilisant l’autre comme témoin. Le pH a été chaque fois contrôlé et réajusté si c'était nécessaire et le dosage des Lipases a été pratiqué selon la technique indiquée au chapitre V. Nous rapportons les résultats de ces analyses dans les tableaux n° 15 et 16, où nous donnons également les résultats d’un essai témoin effectué avec le même résidu levurien, mais non traité préalablement.

TABLEAU N° 13 Dosage des Lipases à partir de 1 g de mycélium desséché de Candida lipolytica en présence d’Huile d'Olive ce NaOH N/I10

l Levures épuisées Age des cultures par Acétone-Ether

Essai | Témoin | Différ.

2 semaines | 4 semaines 0,96 0,54 0,42 0,62 | 0,45

2 semaines | 4 semaines | - | 1,07 |

en oiie

Dosage des Lipases à partir de 1 g de mycélium desséché de Trichosporon pullulans en présence d’Huile d’Olive

Age des cultures

SEMAINES re SÉMTAMER semaines eee: 27 semaines 2227