RIT

au dosage des polypeptides du sérum, en fixe le taux normal.

Ultérieurement, dans sa thèse, CRISTOL, dans le laboratoire de DERRIEN, reproduit et confirme une partie des expériences de l’auteur américain et décrit avec PUECH l'indice de polypeptidémie. Comparant les différentes méthodes de désalbumination du sang, il trouve que l'acide trichloracétique, aux concentrations inférieures à 30 %, précipite les protéines mais laisse passer la plupart des composés azotés intermédiaires, tandis que l'acide tungstique précipite les protéines et les composés intermédiaires.

Avec L. HEDON et PUECH, il constate que pendant la digestion, une certaine quantité de polypeptides traverse la barrière intestinale, mais est arrêtée par le foie. Il cite l'augmentation de la pclypeptidémie dans les néphrites urémigènes, dans l’éclampsie, et dans certains diabètes graves avec gangrène.

C’est alors que Noël FIESSINGER, avec H. R. OLIVIER et Maurice HERBAIN, a décrit l'indice de désamination ou indice de clivage, et a montré son élévation au cours de l'insuffisance hépatique. Ce travail mettait en valeur l'intérêt de cet indice, non seulement au point de vue diagnostique mais aussi au point de vue de la physiopathologie de l'insuffisance hépatique et du métabolisme des polypeptides. C’est que l’origine des polypeptides sériques et même leur existence ont donné lieu à des discussions.

Certains auteurs ont, en effet, prétendu que les méthodes de dosage ne permettaient pas d'affirmer la nature exclusivement peptidique de la substance azotée dosée. Quoi qu’il en soit, examinons les différentes méthodes de dosage employées jusqu'alors.

MorAWITZ et DIETSCHY (1906) essaient de mettre en évidence les produits intermédiaires de la protéolyse par des réactions qualitatives. Le résultat était trop vague pour pouvoir être retenu.

En 1921, E. WOLFF et HAHN utilisent, les premiers, la méthode du double azote en cherchant à doser la diffé-

RE

rence de teneur en azote entre un filtrat d’acide trichloracétique ou métaphosphorique et un filtrat d'acide phosphotungstique ou phosphomolybdique. Ils admettent que le premier filtrat contient l’azote total non protéique, y compris l’azote polypeptidique, tandis que le second ne contient pas l’azote polypeptidique.

CRISTOL et PUECH, puis HILLER et VAN SLYKE mettent au point d’autres techniques qui donnent d’ailleurs des résultats variables d’une méthode à l’autre. Ces derniers transforment les polypeptides en acides aminés par hydrolyse et dosent ceux-ci par la méthode gazométrique. Le dosage, avant et après hydrolyse, montre la quantité de polypeptides du sérum.

En 1926, Paul CHEVALIER essaie de fixer la teneur en protéose du sérum par la coloration obtenue dans la réaction de TANRET.

En 1928, MARTENS, reprenant la méthode de VAN SLYKE, hydrolyse les polypeptides et les transforme en acides aminés; le dosage de ceux-ci dans le sérum, avant et après hydrolyse, est fait par la méthode colorimétrique de FOLIN. La différence donne la mesure de l'azote polypeptidique.

Cette technique a l’avantage de ne faire porter le dosage que sur un seul filtrat. D’après l’auteur, elle à l'inconvénient de ne pas tenir compte du chainon libre d'acide aminé contenu dans chaque polypeptide et, comme celle du double azote, elle expose à l’adsorption inévitable d’une partie des polypeptides au cours de la précipitation.

D'autre part, on peut se demander si l’hydrolyse acide s'attaque à tous les polypeptides et si elle respecte complètement les acides aminés produits. La marge d’erreur d'évaluation colorimétrique pour doser des éléments dont la quantité n’atteint que quelques dizaines de milligrammes par litre de sérum est certainement supérieure à celle du micro-Kjeldahl ; elle porte sur la différence de deux lectures, ce qui diminue encore la précision du dosage.

Pour MARTENS, l'azote polypeptidique est représenté

se Ur

électivement par celui des dipeptides. En réalité, il semble difficile de connaître exactement le volume des molécules examinées. Les polypeptides représentent toute une gamme intermédiaire entre les albumines et les acides aminés; cette gamme comprend à la fois des molécules très grosses et &’autres plus simples, en allant jusqu'aux dipeptides. Les difficultés d'interprétation sont telles que certains auteurs ont été obligés de changer au cours de leurs travaux leur technique de dosage.

La discussion du choix d’une méthode présente plus d'avantages. théoriques que pratiques. Ce qui importe, c'est d'en choisir une qui soit pratiquement réalisable uvec des quantités de sang relativement restreintes et ne comporte qu'une petite marge d'erreur, étant donné le petit volume de la substance à doser; cette erreur est d'autant moins néfaste qu’elle est en proportion constante et permet des examens comparatifs. Et surtout, il faut une méthode qui donne des résultats fidèles qui restent en accord avec les données de la clinique et de l’'expérimentation.

C'est pourquoi nous avons employé la technique du double azote, qui a été mise au point par WOLFF et employée particulièrement par Noel FIESSINGER, avec ses collaborateurs H. R. OLIVIER et Maurice HERBAIN.

TECHNIQUE DE DOSAGE ” DES POLYPEPTIDES DANS LE SANG ET DANS LE LIQUIDE CÉPHALO-RACHIDIEN

Son principe se base sur la différence entre l'azote du filtrat trichloracétique et l’azote phosphotungstique. On peut ainsi doser les polypeptides, avec une approximation de 2 à 3 % environ.

1° Les précipitations. — La précipitation trichloracétique se fait en mélangeant :

cm de sérum et

D 5 cem* d’acide trichloracétique à 20 %

La précipitation phosphotungstique s'effectue en mélangeant dans l’ordre :

SÉTUN RS ere derriere er Tee ee 5 cm° Fauibidistilée 7 tn ere. 10 cm* Phosphotungstate Na à 10 %......... 5-cm* Aide SUURIQUEIU HÉRNEEERPER RACE NE 5 cm*

2° Les filtrations. — Les liquides sont passés sur

filtre sans plis et rejetés sur leur filtre jusqu’à ce qu’ils passent limpides.

3° La kjeldahlisation. — Deux tubes en pyrex recoivent :

L'un : 1 em* de filtrat trichloracétique, L'autre : 2 em° de filtrat phosphotungstique.

Chaque essai est additionné de 3 cm° de mélange destructeur de LAUDAT.

Le chauffage mené avec les précautions ordinaires se fait jusqu’à décoloration complète.

4° Le dosage de l'ammoniaque ainsi formée se fait à l'appareil de PARNASS et WAGNER, dont l'emploi est aujourd’hui courant.

L'ammoniaque, déplacée. par la soude, est entraînée par un courant de vapeur d’eau et reçue par distillation dans une solution titrée d’acide sulfurique, employée en quantité connue et en excès, excès que l’on dose ensuite par la soude, en présence de rouge de méthyle, en évitant le plus complètement possible les erreurs dues au CO:.

A titre de contrôle, tous les dosages ont été faits en double, l’erreur expérimentale est toujours de l’ordre de 2 % environ.

L'erreur due au réactif est déterminée dans un essai à blanc effectué selon la technique précédente, en remplaçant le sérum par de l’eau bidistillée. Le chiffre obtenu est retranché des résultats extérieurs.

Le résultat final s'écrit :

N. trichloracétique — N. phosphotungstique — N. polypeptidique et l’indice d'insuffisance de clivage :

N. polypeptidique IC=

N. trichloracétique

Les résultats de ces dosages sont exprimés en milligrammes par litre de sérum.

CONDITIONS TECHNIQUES (avec Mlle Gibert)

Dans la méthode du double azote, comme dans toutes méthodes de dosage des polypeptides, on a insisté sur l'importance d'opérer avec des solutions comparables par leur densité protidique, la richesse des filtrats azotés

Là 20). S Vie

obtenus étant inversement proportionnelle à la teneur en protides des solutions mises en présence des réactifs. A quantité égale de polypeptides, le sérum apparaît moins riche que le liquide céphalo-rachidien, parce que ce dernier contient moins de protides. Il est donc nécessaire d'employer plutôt le sérum que le plasma qui, par suite de son fibrinogène, est plus chargé en protides. Nous avons ainsi observé, avec Mlle GIBERT, que le sérum obtenu par coagulation de 24 heures avec hémolyse se montrait, pour la même raison, moins chargé en polypeptides que le sérum recueilli immédiatement sans hémolyse.

Indice N.trichl. N.phosph. N. polyp. de cliv.

Sérum immédiat ... 302 242 60 0,19 Sérum après 24 h.

de glacière avec

son caillot. Hémo-

OT R MOISPE E 388 332 56 0,14

Par contre, l’autolyse de 48 heures à 37° augmente nettement sous toluène le taux de l’azote polypeptidique par suite d’une protéolyse surajoutée. Ces constatations, sur lesquelles nous n’insisterons pas, nous ont engagé à n’opérer que sur le sérum immédiat obtenu par une centrifugation énergique du sang recueilli avec un minimum de traumatisme pour éviter l’hémolyse.

Une épreuve préliminaire nous a montré que dans ces conditions la méthode du double azote, telle que nous la pratiquions avec du sérum, permettait de retrouver les taux polypeptidiques ajoutés.

L'approximation est suffisante pour autoriser l’emploi de cette méthode dans les conditions fixées. Cette épreuve préliminaire vérifie d’ailleurs une épreuve pratiquée par H. R. OLIVIER et vient confirmer les expériences de CRISTOL.

Dosage dans le liquide céphalo-rachidien

Pour le liquide céphalo-rachidien, la technique est modifiée ainsi :

La précipitation trichloracétique se fait en mélangeant :

em* de liquide céphalo-rachidien et cem* d’acide trichloracétique à 20 %

at ot

La précipitation phosphotungstique, en mélangeant dans l’ordre :

liquide ncéphalo-rachidien "#52 702 5 cm° Lau. bidistilée Re ARTE rer a 10 cm° Solution de phosphotungstate Na à 10 %.... 5 cm° Acidestfurique AND SAN PP PE RER Re 5 cm*

Il y a avantage à opérer ces précipitations dans des flacons d’émeri que l’on abandonne en un lieu frais pendant au moins six heures, la précipitation dans un liquide aussi peu riche en albumine étant toujours très lente.

Les liquides, après un court séjour à la température du laboratoire, sont ensuite filtrés sur un double filtre sans plis.

Le reste de l’opération est mené de la même façon que pour le sérum.

Comme l’avait constaté VAN SLYKE, la teneur des filtrats azotés est d'autant plus élevée que les solutions protidiques en présence des réactifs sont plus diluées. La quantité d'azote polypeptidique s'en trouve un peu élevée, La comparaison entre la polypeptidémie et la polypeptidorachie demeure toute relative, en raison de la concentration différente en protides coagulables des deux milieux. Mais la valeur comparative des chiffres trouvés dans chaque milieu n'en est pas modifiée.

| [Re] Qt |

Résultats des dosages

Pour apprécier les résultats que nous allons donner, il faut rappeler que l’azote polypeptidique sanguin oscille normalement chez l’homme entre 40 et 60 mer.

par litre et que l'indice d'insuffisance de clivage oscille entre 0,10 et 0,12.

Par contre, l’azote polypeptidique rachidien est au voisinage de 0 et dépasse rarement le taux de quelques milligrammes.

Chez le chien, la polypeptidémie veineuse est variable suivant Je régime alimentaire; elle varie entre 60 et 80 mer. par litre de sérum.