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Pour étudier le rôle des acides ou des alcalis sur le développement de nos espèces, nous avons employé les liqueurs normales de chacun des composés mis en expérience ; cela permet, en négligeant leurs tensions superficielles légèrement différentes, de comparer l’action nocive des molécules entre elles :

Acides: 1 goutte de la sol. Nd’ac. chlor-

hydrique contient...7,..... 0,001825 de HCI 1 goutte de la sol.N d’ac. azoti-

AUCH NL Te one ge 0,00315 de AzOFH 1 goutte de la sol.N d’ac. sulfu-

FIMO CONLICNES SE Res 0,00245 de SO*H?

1 goutte de la sol.N d’ac. oxali-

que Contient. sent rs . 0,00315 de C20*H?2+2H20

Alcalis: 1 goutte de la sol. N de D

CONUENEE ER Ernie mem ce 0,0028 de KOH 1 goutte de la sol. N de soude

contient..... AVE a DORE 0,002 de NaOH.

Chacune de ces solutions est ajoutée à 10° de Raulin neutre au tournesol dans la proportion suivante : tube n° 1, témoin ; tube n° 2, IV gouttes; tube n° 3, VIII gouttes et ainsi de quatre en quatre gouttes jusqu’à quarante. Dans les cas assez rares où ce nombre n’est pas suffisant, nous concentrons à 8‘ les 10° de Raulin et on continue par quarante-quatre, quarante-huit, etc., jusqu'à quatrevingts gouttes. Les tubes sont ensuite ensemencés de conidies et placés à l’étuve à 37°.

Les résultats obtenus ne sont pas d’une valeur absolue, pour les raisons suivantes :

A) Plus nous ajoutons de solution normale dans un tube, plus nous augmentons la quantité d’eau. Pour déterminer l’influence de cette dilution du liquide nutritif, nous avons fait des cultures sur Raulin normal et Raulin dilué au 1/5. L'aspect restant le même pendant les huit jours d’observation, nous avons dû avoir recours à la pesée pour noter de légères différences :

Fe se

Raulir normal Raulin dilué au 1/5 Aspergillus fumigatus.... 381 milligr. 318 milligr. Sterigmatocystis lutea.... 402 — 347 — Pæcilomyces Varioti..... 280: — 2435 —

Nous avons opéré ici avec la dilution maxima qui n’est jamais dépassée ; il est donc permis de considérer les tubes extrêmes comme ayant sensiblement même pouvoir nutritif.

B)Sous l’action d’un acide, le saccharose peuts’intervertir en totalité où en partie. GUÉGUEN [36] a montré que le Penicillium glaucum se développe mieux sur un mélange de glucose et de lévulose que sur le saccharose. Ce dernier, après interversion, est en général, dit LaBoRDE [51], «un aliment de prédilection pour les moisissures ». Nous avons aussi remarqué que les cultures sur glucose et saccharose sont après quelques jours identiques. De fait, on doit considérer l’interversion comme augmentant la valeur nutritive du milieu. Er

C) Lorsqu'un acide est ajouté à du Raulin neutre, il se trouve saturé en partie par la potasse et la magnésie ; mais surtout, il déplace, dans le cas de lacide sulfurique par exemple, l’acide azotique de l’azotate d’ammoniaque.

Dans 10% de Raulin contenant 0 gr. 03 de ce sel, il peut

ÿ AVOÏT = = Ogr. 0236 d’acide azotique libre; cette dose n’est même pas suffisante pour arrêter le développement du Sterigmalocystis nidulans, qui s’est montré la plus sensible de nos Mucédinées à l’action de l'acide azotique (dose-limite pour 10° de Raulin = 0 gr. 0378). Cependant RAuziN explique par la présence de cet acide, plus funeste peut-être à la végétation, les différences entre ses résultats et ceux trouvés par Van TIiEGHEM au sujet des quantités d'acide sulfurique capables d’arrêter la croissance du Sterigmatocystis nigra.

Nous négligerons encore cette dernière cause d’erreur qui est la plus importante de celles que nous venons d’énumérer, et nous appellerons tube-limite celui dans lequel,

RES TRSRS

après quinze jours, il n'y à pas eu de culture apparente. Appliquant ici la méthode très précise donnée par Gué- GUEN [42] pour la détermination des pouvoirs antiseptiques, nous conclurons que la proportion d'acide ou d’alcali, contenue dans le tube resté stérile, a produit lPinhibition. Soit P, le poids du tube plein; p, le poids du même tube vidé et séché; P-p représente le poids du liquide (Raulin +solution normale). Soit, d'autre part, À le poids d’acide ou d’alcali contenu dans une goutte de la solution; »#, le nom-

sue exprimera RSCEN

bre de gouttes introduites, la formule

le pouvoir inhibitoire.

Action sur les composés sucrés et azotés. — Tous les aliments ne sont pas directement assimilables par les êtres vivants ; ils doivent subir ‘au préalable une transformation moléculaire qui s’opère sous l’action de substances actives sécrétées par l'organisme, et auxquelles on donne le nom d’enzymes. DucLaux [26] a réussi à déceler dans l’Aspergillus niger la sucrase et l’amylase ; BourQuELoT [10] y a démontré en outre la sécrétion de tréhalase, d'émulsine, d’inulase et de trypsine. Nous ne rechercherons ici qu'un petit nombre de ces enzymes, particulièrement ceux d’un intérêt biologique ou industriel ; la trypsine, la présure et la caséase parmi les ferments protéolytiques ; la zymase alcoolique, la sucrase, la maltase, la lactase et l’amylase parmi les ferments des hydrates de carbone.

Trypsine. — Elle transforme l’albumine en albumose et peptone. Pour préparer le milieu-réactif, on prend parties égales d’albumine d’œufde poule frais et d’eau distillée, on agite vivement, on passe sur un carré de tarlatane pour séparer les membranes, on répartit dans des tubes inclinés et on stérilise par tyndallisation à 100°.

Les tubes sont examinés un mois après leur inoculation. S'il y a présence de trypsine, le blanc d'œuf devient trans-

A Mess

parent, se liquéfie peu à peu et la liqueur filtrée donne la réaction du biuret (lessive de soude: 4° quelques gouttes, sol. de sulfate de cuivre à 1 p. 0/0, dans 1% liqueur — coloration violette).

Présure et caséase. — La préparation du lait qui sert à la recherche de ces ferments se réduit, après écrémage, à une simple stérilisation à 110°. Après quinze jours de culture, le milieu a subi. A) soit une coagulation (qui provient parfois de la transformation du lactose en acide lactique, mais qui sera due à la présure si elle se produit dans un second essai avec du lait contenant du carbonate de chaux pur et précipité, destiné à neutraliser l'acide au fur et à mesure de sa production) ; B) soit une peptoniftcation. (Les flocons de caséïne sous l’action de la caséase disparaissent peu à peu, « pour donner naissance à un liquide jaunâtre, un peu visqueux et opalescent »). Mais ce ferment peut être le seul produit par le champignon et « le lait sans se coaguler se transforme peu à peu en un liquide transparent et jaunâtre » (GrimBerr [34]). C’est encore ce qui se produit lorsque la caséase plus abondante que la présure masque la présence de cette dernière en peptonifiant la caséine avant que la présure puisse agir.

Zymase alcoolique. — Pour l'étude de cet enzyme et des suivants, nous employons du Raulin neutre, non sucré, additionné de 5 ?/, d'hydrate de carbone, que l’on répartit par 20% dans de petits matras. On stérilise par tyndallisation à 80° pour éviter l’altération de certains sucres, et après inoculation on laisse à l’étuve à 37° pendant quinze jours. Nous n’analyserons pas les produits complexes qui ont pu se former; nous constaterons seulement, par des réactions simples, les changements survenus dans la composition du milieu. Le Raulin glucosé, s’il y a sécrétion de zymase alcoolique, contient de l’alcool que nous mettons ainsi en évidence : 10* de la liqueur distillée sont divisés

lgsres

en deux parts. On ajoute : à l’une, 1 goutte de bichromate de potasse au 1/10 5 gouttes d'acide sulfurique et l’on chauffe : la coloration passe du jaune au vert; à l’autre, 1°° d'iodure de potassium au 1/10+-10 gouttes de lessive de soude et goutte à goutte de l’hypochlorite de soude; il se forme de l’iodoforme reconnaissable à son odeur et à l’examen microscopique (lamelles hexagonales).

Sucrase. — Produit linterversion du saccharose. Le lévulose formé est lévogyre et son pouvoir rotatoire est en valeur absolue beaucoup plus élevé que celui du glucose ; ils réduisent tous les deux la liqueur de Fehling. Les propriétés optiques et réductrices de la solution indiquent nettement la réaction.

Mallase. — Dédouble le maltose en deux molécules de glucose. Le pouvoir rotatoire du premier est de + 138°,38, celui du second : 2 X + 52,74; la rotation à droite de la solution est diminuée, mais on a une augmentation du pouvoir réducteur, ce dernier étant pour le maltose les 2/3 environ de celui du glucose.

Lactase. — MHydrolyse le lactose et donne du glucose et du galactose. Ces trois sucres sont dextrogyres. Le pouvoir rotatoire du galactose étant un peu plus élevé que celui des deux autres, la rotation à droite sera légèrement supérieure ; mais pour plus de certitude nous employons la phénylhydrazine qui, dans les cas précédents, peut aussi être utile. La présence de glucosazone se formant à chaud, soluble dans l'alcool méthylique et l’acétone diluée au demi, complètera heureusement l'examen polarimétrique.

Amylase. — Sous l’action de ‘cet enzyme, la gelée d’amidon, de consistance demi-solide, se désagrège peu à peu et donne naissance à un liquide clair ou opalescent,

EE) fie

qui avec l’eau iodée prend une teinte successivement violacée, rouge (erythrodextrines) et jaune. Quand on n'obtient plus de coloration, l’amidon se trouve remplacé par un mélange de dextrines (achrodextrines) et de maltose. « Presque toujours cependant, avec la diastase ordinaire « ou avec les sécrétions organiques réputées comme ren- « fermant de la diastase, il se forme, outre ces deux corps, « du dextrose ; c’est que cette diastase ou ces liquides « renferment de la maltase » (BourQuELoT [11)}).

LABORDE [51] a désigné sous le nom d’amylo-maltase ce double ferment qu’il croit unique et spécial à quelques moisissures, et dont l’action diffère de celle de lamylase en ce que le terme maltose se trouve dépassé. Il a remarqué que l’£urotiopsis Gayonti, l’'Aspergillus niger et le Penicillium glaucum, végétant sur l'amidon, le dédoublent jusqu’à le conduire au terme glucose.

Tous ces enzymes seraient facilement mis en évidence par les réactions que nous venons d'indiquer, si les produits de dédoublement demeuraient en quantité constante, mais la nutrition protoplasmique en absorbe une grande part et fausse dès lors nos résultats. Aussi, pour rechercher ces ferments, mettrons-nous en œuvre le procédé bien connu de DucLAUx, qui consiste à obtenir un liquide de macération du thalle vivant. Pour éviter l'introduction dans ce liquide d'organismes microbiens apportés par l'air ou les vases d’expérience, nous avons imaginé le dispositif suivant [47], qui permet d’opérer aseptiquement.

Un cristallisoir humide A est recouvert d’un vase plus large B, à fond bombé ; dans une tubulure latérale D passe un tube recourbé C, dont la branche verticale descend jusqu’au fond du cristallisoir, le bout extérieur du tube étant muni d’un raccord de caoutchouc que bouche une baguette de verre F. On garnit de coton cardé la tubulure et l’espace existant entre les parois des deux vases. Pour faciliter le maniement de l'appareil, on insère

CP 7e

dans l’espace annulaire quelques tronçons de tube de caoutchouc, qui assurent un calage parfait. Le vase à culture étant ainsi préparé, on le stérilise à l’autoclave à 120°. D'autre part, on dispose un ballon contenant 50 de Raulin et dont le bouchon est traversé de deux tubes ; lun G coudé à angle droit pénètre légèrement à l’intérieur, l’autre H plonge jusqu’au fond du liquide ; lun et l’autre sont fermés par un peu de coton. Le tout étant stérilisé, on ensemence avec des conidies de la Mucédinée. Pour transvaser aseptiquement le liquide dans le cristallisoir, on retourne le ballon le col en bas, le tube G étant préalablement relié au tube C. Trois jours après, on soutire, # l’aide d’un siphon, par ce même tube CG, tout le liquide qui se trouve sous le voile. Sans déchirer ce dernier, et en opérant comme précédemment, on renouvelle une seconde fois le liquide de Raulin que l’on siphone à nouveau après trois jours. Le voile est enfin lavé pendant 5 à 6 heures à l’eau distillée, dont on remet 50° en contact avec la culture pendant 48 heures. La plante abondamment nourrie, se trouvant ainsi privée de substances nutritives, commence à utiliser ses réserves ; les diastases sont alors sécrétées en grande quantité. Elles se dissolvent dans le liquide sous-jacent, qui ne contient en outre qu'un peu de matière organique et des traces de sels minéraux. Ce liquide, décanté et filtré aseptiquement, est réparti par dose de 5% dans des tubes contenant, soit de

LPO

petits cubes d’albumine coagulée où de fromage blanc, soit du lait additionné de CO'Ca et de 2 1/,, de CaCR, soit 20 « de solution à 5 ©}, de glucose, saccharose, lactose ou maltose, soit enfin de l’empois d’amidon à 5 ?/, et stérilisés préalablement par tyndallisation. Tous ces mélanges sont laissés quatre jours à l’étuve à 37° et analysés d’après les méthodes indiquées pour les cultures directes. Des tubestémoins, dans l’un et l’autre cas, serviront de termes de comparaison.

Par ce procédé, le seul que nous ayons employé, nous n'obtenons que les diastases extra-cellulaires, celles qui émigrent en dehors de la membrane et se dissolvent dans le liquide ambiant. Dans le Monilia candida, dont la nutrition se fait avec le saccharose, HANSEN n’a pas rencontré de sucrase, mais FiscHEr y découvrit cet enzyme qui, retenu fortement par le protoplasme, n'apparaît pas à l'extérieur. De même, BourQuELoOT et GRAZIANI [12] ont démontré que le Penicillium Duclauxii contenait de l’invertine, mais ne la laisse pas diffuser au dehors. Pour obtenir ces diastases intra-cellulaires, il est nécessaire de déchirer les paroïs de la cellule en broyant le thalle avec du sable et de l’eau. BourQuELoT [10] a ainsi extrait la plupart des ferments de l’Aspergillus niger et Pinarp [66] ceux des Aspergillus repens et clavatus. Le procédé de Bücaner pour les levüres a été aussi appliqué aux Mucédinées ; JuxrrzkY [48], en broyant une grande quantité de cultures mycéliennes avec du sable fin et en exprimant le mélange sous une pression de 300 kilog. par centimètre carré a extrait de l’Aspergillus niger un suc transformant rapidement le glucose en alcool et en gaz carbonique. Le mycélium de ce champignon renferme donc une zymase alcoolique en plus des autres ferments énumérés.

Nous nous abstiendrons de donner les résultats négatifs obtenus dans nos recherches, en voyant combien de ferments solubles ne peuvent être mis en évidence par notre

Eros

méthode. De plus, la production des enzymes pour un seul et même être est en rapport avec le mode d'alimentation et nous avons employé exclusivement le Raulin normal

comme milieu nutritif.