CHAPITRE II

Technique. pour l'étude pathogénique.

La plupart des affections mycotiques, que nous avons citées au début de ce mémoire, s’observent chez des animaux sauvages conservés en captivité depuis plus ou moins longtemps. Aussi certains auteurs, SPRING [84] et Rogix [73] entre autres, ont considéré les Mucédinées comme des saprophytes, contaminant seulement des organes affaiblis ou malades. « L’expérimentation prouve, au contraire, que les moisissures, au moins celles dont évolution se fait à une température élevée, sont capables de développer une affection spéciale ayant sa gravité propre, parfois contagieuse et même épizootique » (LUGET).

GRone et son élève Brocx, en 1870, injectent les premiers dans les veines d’un lapin, 2 à 3 d’une émulsion de conidies d'Aspergillus glaucus, de Penicillium glaucum et de levüres. Les animaux meurent en 30 ou 36 heures et à l’autopsie on trouve, surtout dans le rein, un semis de points blancs formés par un mycélium, se développant au milieu d’un tissu nécrosé, infiltré de leucocytes. Gxawirz, en 1877, reprend ces expériences avee les mêmes organismes, etobtient des résultats négatifs ; il en conclut que Gone avait dû injecter des spores d’un champignon virulent en même temps que celles du Penicillium

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et de l’Aspergillus. Trois ans plus tard, Grawirz admet à tort qu'une moisissure inoffensive devient pathogène si on l'amène graduellement à cultiver à 37° sur un milieu alcalin et liquide comme le sang, et que la virulence disparait par retour aux conditions normales de végétation. Ces assertions un peu surprenantes suscitent de nouvelles recherches de Kocx et Garrky (1881), dont les expériences montrent que, quels que soint les moyens de culture employés, l’Aspergillus glaucus est toujours pathogène et jamais ne le sont le Penicillium glaucum ni l'Aspergillus niger. L'année suivante, BAUMGARTEN et Muzrer obtiennent des résultats analogues et KAUFMAN suppose que, dans les cultures de Grawirz, l’Aspergillus glaucus cultivant bien à 37° était remplacé à la température ordinaire par l’Aspergillus niger non virulent. Il résulta de ces affirmations contradictoires une polémique assez vive entre Kocx et Grawirz. LicarHeirm (1882) mit fin à leur discussion, en démontrant que ces auteurs avaient expérimenté avec des espèces diverses, inexactement déterminées ou dont les cultures étaient impures. Le champignon désigné sous le nom d’Aspergillus glaucus comprenait en réalité deux espèces : lune à grosses spores, fructifiant à la température ordinaire et inoffensive; l’autre presque de même couleur, à petites spores, végétant à 37°, très pathogène ; c'était l’Aspergillus fumigatus de Fresenius. Ces résultats furent confirmés par DE Bary. En 1897, Lucer [55]et RÉNON [72] publient une étude très complète de l’aspergillose expérimentale et spontanée, où ils ont condensé toutes leurs recherches antérieures. En 1900 parait le travail de Saxe [80] sur la pneumomycose aspergillaire, avec de très intéressantes descriptions et d'excellentes figures des lésions produites par l’inoculation aux animaux. G. BarTHELAT [3] en 1903 étend aux Mucorinées la méthode expérimentale, et à la même époque Ch. Macé [58] fait des essais sur le Gobaye, le Pigeon, la

Tortue, la Couleuvre et la Grenouille, avec des conidies d’'Aspergillus fumigatus et d'un Aspergillus glaucus qui n’est évidemment qu'une variété du précédent. Enfin en 1906, Pinoy [68] réussit à obtenir un mycétome à Sterigmatocystis nidulans chez un Pigeon inoculé à la patte.

Dans l'étude pathogénique de nos Mucédinées thermophiles nous empruntons à tous ces expériméntateurs les procédés qu'ils ont mis en œuvre.Pour ses cultures LICHTHEIM se servait d’eau panée gélosée; nous avons essayé de remplacer le pain par l’eau de carotte, le bouillon, le Raulin normal et le Raulin neutre. Avecle Raulin acide, la gélose est hydrolysée même après simple chauffe à la vapeur fluente ; parmi les autres milieux, le Raulin neutre est celui qui donne les cultures les plus vigoureuses, nous l’avons constamment employé après addition de 21}, de gélose. Cette préparation, qui supporte facilement une stérilisation à 110°, est répartie dans des fioles de Gayon (diamètre du fond = 15 centimètres) par quantités de 60% environ. Quand les cultures ont atteint leur maximum de croissance (5 à 7 jours après l’ensemencement), on verse dans le flacon 10 à 20% de sérum physiologique (chlorure de sodium : 7 gr. 5 par litre) et l’on agite vigoureusement. La solution se trouve chargée de conidies; pour la débarrasser des fila ments mycéliens qui pourraient occasionner une embolie mortelle, on la filtre sur un entonnoir stérilisé dont la douille est garnie d’un tampon de coton peu serré ; on la recueille dans un petit verre conique fermé par un diaphragme de papier buvard, dont on perfore le centre avec la douille de l’entonnoir. Le filtrat, qui ne contient plus en suspension que des conidies, est inoculé à l’aide d’une seringue Pravaz, soit dans le péritoine du Cobaye, soit dans la veine marginale (postéro-externe) de l’oreille du Lapin.

Avant toute opération, le poil est rasé et la place lavée

au sublimé puis à l’alcool-éther ; de même, dès que l'aiguille est retirée, on cautérise au fer rouge l'endroit de la piqüre, ce qui assure l’asepsie et arrête toute hémorragie.

Lorsque l’inoculation amène la mort de l'animal, on doit immédiatement (au plus tard quelques heures après le décès) pratiquer l’autopsie ; pour cette dernière, on se sert de ciseaux, scalpels et pinces stérilisés et l’on opère de manière à éviter toute contamination extérieure. Une parcelle de chacun des organes prélevés dans ces conditions est projetée dans des matras contenant du Raulin normal stérilisé ; l’un de ces matras reçoit une goutte de sang puisé directement dans le cœur à l’aide de la pipette protégée [41]. Si la mort est due à l’action de la Mucédinée et non à une faute opératoire, les cultures sont positives ; le sang a disséminé les conidies dans tout l’organisme, mais lui-même reste souvent stérile.

L'examen histologique fournira la preuve certaine du rôle pathogénique de la Mucédinée. Des tranches d’organe de 1 centimètre de long, 1/2 cent. de large sur 2 à 3 millimètres d'épaisseur sont fixées au moment même de l’autopsie par le sublimé acétique ou lalcool à 95°, durcies aux alcools de plus en plus concentrés, puis incluses dans la parafline. Le bloc de parafline obtenu, est débité en coupes minces que l’on colle sur lame par l’albumine de Mayer ou la gélatine bichromatée.

Pour colorer les coupes après leur passage dans le picrocarmin de Orth, Lucer les plonge pendant quelques heures dans une solution aqueuse de violet de méthyle ou de violet de gentiane et en suivant la méthode de Gram- Weigert il obtient une coloration violette intense du mycélium ; RÉNoN les laisse une minute à peine dans une solution de thionine phéniquée ; BarrHeLar les met pendant quatre à cinq minutes dans une solution aqueuse à 2 1}, de bleu de toluidine (le rouge de ruthénium est recommandé

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par l’auteur). Nous avons employé avec assez de succès ces colorants ; au lieu de la coloration primitive en masse par le picro-carmin, nous faisons agir directement sur la lame une solution d'hématoxyline, puis pendant quelques minutes un mélange de 3 p. alcool absolu et 1 p. solution aqueuse d’éosine à 0,50/,. Sur un fond rosé se détachent les noyaux violets des cellules et les filaments mycéliens apparaissent également en violet plus ou moins foncé (violet de gentiane, thionine, bleu de toluidine). On passe ensuite par les alcools forts et l'on monte finalement dans le baume de Canada.

L'examen des préparations ainsi obtenues montre nettement que l’aspergillose se localise surtout dans le rein et le foie ; la rate et le cœur sont assez souvent atteints. De ces organes, les uns sont hypertrophiés, les autres présentent à leur surface des points blancs miliaires assez caractéristiques ; à leur intérieur, on rencontre généralement des tubercules blanchâtres constitués par un amas de filaments mycéliens enchevétrés, entourés de nombreux leucocytes. Ces nodules plus ou moins volumineux ont une grande ressemblance avec les lésions de la tuberculose bacillaire. Nous nous sommes occupés de déterminer les quantités de conidies de chaque espèce qu'il fallait introduire dans l’organisme pour amener soit des accidents guérissables, soit la mort. En injectant des doses extrémement faibles, la guérison survient en effet après quelques jours d’affaiblissement ; à doses plus fortes, la mort arrive au bout d’un temps plus ou moins long; elle est très rapide aux doses massives que nous avons généralement employées. Comme OLSsEx et GADE [64] pour l'Aspergullus subfuscus, nous déterminons approximativement, à l’aide d’un compte-globules, le nombre des conidies contenues dans nos émulsions.

Comment évoluent les conidies introduites dans lPorganisme vivant? D'après Grawrrz, les spores de champi-

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gnons non pathogènes, après un séjour plus ou moins longs dans le sang, s’éliminent par les urines. La plupart des auteurs que nous avons cités après luise sont occupés de cette question ; nous ne rapporterons que les importantes et récentes observations de Bopin et SavouRé [7]. Une moisissure pathogène ou non détermine, quand on l'injecte dans le péritoine d’un cobaye, une Jleucocytose abondante comparable à celle que l’on peut obtenir en injectant dans le péritoine des fragments d’une matière pulvérulente quelconque ; les cellules phagocytaires ne semblént pas faire de distinction entre les spores virulentes et les spores inoffensives, qu’elles englobent les unes et les autres comme des corpuscules inertes. Les conidies, qui n’ont pas de mouvement propre, sont récoltées par les leucocytes, disséminées dans tout l'organisme et viennent se loger dans les capillaires viscéraux. C’est pourquoi on peut les rencontrer 3 et 6 jours après l’inoculation dans le foie, le rein et la rate. Mais à ce moment les phénomènes varient, suivant qu'il s’agit où non d’un champignon pathogène: dans ce dernier cas, les spores germent et produisent des altérations locales ; s’il s’agit, au contraire, d’une espèce non pathogène, elles disparaissent après un temps plus ou moins long, sans être éliminées par les émonctoires. En examinant attentivement ces faits, on constate que tout se ramène à une question de digestion intra-cellulaire. « En effet, quand on inocule un champi- « gnon pathogène, il y a bien englobement de ses spores « par les leucocytes, mais pour des raisons encore mys- « térieuses tenant au fonctionnement physiologique de ces « phagocytes ou peut-être à la structure des spores mieux « protégées que d’autres, il n’y a pas de digestion intra- « cellulaire de ces spores, qui demeurant intactes germent « ultérieurement. La phagocytose est alors incomplète, car « ce phénomène comporte nécessairement et essentielle- « ment deux temps: l’un d'ordre physiologique, compre-

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nant l’englobement des éléments étrangers dans le protoplasme de la cellule mobile; l’autre d'ordre chimique, consistant en une digestion des corpuscules englobés par des cytases élaborées par la cellule; et avec les spores de champignon pathogène cette dernière partie de l’acte fait défaut. Dans le cas d'un champignon non pathogène, au contraire, les phagocytes complètent leur œuvre d’englobement par un acte digestif qui aboutit à la destruction des spores ». « On peut dire que l’immunité dans les mycoses internes dépend de phénomènes de digestion intra-cellulaire par les phagocytes de l’organisme parasite ». Il ÿ aurait donc, d’après ces expéri-

mentateurs, analogie entre les aspergilloses et les maladies microbiennes. -