TROISIÈME PARTIE

Ferments.

Oxydases et anaeroxydases.

Tous les organes contiennent des ferments engendrés par le protoplasma et possédant des propriétés diverses; les uns, comme l’amylase, transforment l’amidon en maltose, ils peuvent se trouver dans la plupart des cellules animales ; certains, comme les sucrases ou invertines, dédoublent le sucre de canne en glucose et lévulose, tandis que la lactase donne de la glucose et du galactose lorsqu'elle est en présence du sucre de lait. On rencontre aussi dans certains d’entre eux des ferments capables de décomposer les matières albuminoïdés en produits plus simples et généralement dialysables. C’est ainsi que la pepsine sécrétée par les glandes gastriques est un ferment qui, en milieu acide, dédouble les albumines en albumoses et peptones ; la trypsine du pancréas, que l’on peut rencontrer aussi bien chez certains champignons que chez les animaux, peptonise les albuminoïdes en liqueurs neutres ou alcalines. Une autre classe de ferments hydratants comprend ceux qui sont aptes à saponifier les corps gras et les éthers; on les trouve dans le pancréas, dans lé sang et par suite en petite quantité dans les organes non lavés. On connaît enfin des ferments coagulants, des enzymes hydratant l’urée pour la transformer en carbo-

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nate d’ammoniaqne et dans le règne végétal surtout, des ferments oxydants et d’autres réducteurs; ces derniers ayant été récemment étudiés par MM. Abelous et Gérard.

Je n’ai retenu que les ferments oxydants et les anaeroxydases recherchés et signalés dans le règne animal, car les autres sont suffisamment connus, comme ceux du pancréas, ou bien ne se rencontrent guère qu’à l’état de traces dans les organes

er + que j'ai examinés.

Les agents oxydants ou oxydases, pour employer la terminologie actuelle, sont en réalité les substances que Schünbein à désignées il y a longtemps sous le nom de substances excitatrices de l’oxygène (Sauerstofferreger); elles peuvent produire, au contact de l'air, l'oxydation de certains composés, en donnant naissance à des coloratiens plus ou moins caractéristiques. Elles déterminent le bleuissement de la teinture fraîche de résine de gaïac et donnent avec le gaïacol une teinte rouge grenat, D’après M. Bourquelot, les substances oxydantes capables de provoquer les réactions colorées dont je viens de parler sont nombreuses; elles ont été rangées par lui en quatre catégories principales, indispensables à connaître afin d'éviter les confusions et les erreurs qui se sont glissées quelquefois dans les recherches de ce genre.

Le premier groupe comprend l'ozone. Si on plonge unc bande de papier imprégné de teinture de résine de gaïac dans l'atmosphère d’un flacon contenant un peu d’eau et des bâtons de phosphore, ce papier ne tarde pas à se colorer en bleu, par suite de l’oxydation de l'acide gaïaconique de la résine par l’ozone qui s’est formé dans les conditions de l’expérience. Schünbein a déjà montré que certains sucs végétaux peuvent retenir l’ozone et donner une réaction semblable qui n’existe plus après ébullition du liquide. La perte par la chalcur d’une telle propriété oxydante n’est donc pas suffisante pour caractériser une oxydase.

Le second groupe comprend les ozonides ou porte-ozone. Telle est la quinone, dont la solution aqueuse bleuit la teinture de gaïac, donne une teinte rouge grenat avec le gaïacol et bleue violacée avec le naphtol, etc.

Si maintenant cette solution est additionnée de liquides

organiques, notamment ceux qui renferment des matières albuminoïdes, le lait par exemple, leurs propriétés oxydantes disparaissent lentement à froid et instantanément à l’ébullition. Ces solutions de quinones dans les milieux organiques se comportent donc comme un grand nombre de macérations fraîches de plantes. Si on se contente de constater une réaction colorée qui ne se produit plus après l’action de la chaleur, on pourra encore se trouver en présenee d’ozonides analogues à la quinone et non de véritables oxydases.

Les substances rangées dans la troisième catégorie de M. Bourquelot sont oxydantes par l'oxygène de l'air auquel elles communiquent une activité chimique qui lui permet d’oxyder certaines substances mises en présence, réactions que l'air seul n’aurait pu produire sans l'intervention de l’oxydase. Dans ce cas, et c’est là Le caractère essentiel de ces substances, il y a toujours absorption d'oxygène lorsqu'on ajoute au liquide qui les contient des composés oxydables sous leur influence.

Cette absorption d'oxygène peut être révélée par des mesures et une expérimentation particulière ou plus simplement par ce fait que la réaction ayant lieu toujours aux dépens de l’oxygène de l’air, les produits colorés, lorsqu'il doit s’en former, sc font au début toujours à la surface des liquides.

Enfin il existe une dernière classe de substances dont l’action oxydante n’est observée qu’en présence de l’eau oxygénée. Elles possèdent la propriété de décomposer ce dernier corps de telle sorte qu’une partie de l’oxygène mis en liberté peut se fixer sur les matières oxydables. |

Schünbein a montré que ces agents sont très répandus dans les graines et le règne végétal, mais on les rencontre aussi plus ou moins actifs dans les organes animaux et dans le sang. Elles perdent leurs propriétés après ébullition, c’est-à-dire au voisinage de 100° et le plus souvent à une température un peu plus élevée entre 110 et 120°. Tous ces corps oxydants avaient été étudiés ou entrevus par Schünbein dont les premiers travaux datent de 18537. Ses importantes découvertes sur ce sujet furent sans doute incomprises à son époque ou passèrent à peu près inaperçues, car il fallut attendre les travaux de MM. Bourquelot et Bertrand sur la même question pour en

+ comprendre l’importance, et, récemment encore, Schäer, élève de Schünbein, dut reprendre dans leur ensemble les recherches de son maître afin d’en établir la chronologie et d’en faire ressortir toute la valeur. Toutefois, il semble que les contemporains ont seuls mis en lumière le caractère essentiel des oxydases, c’est-à-dire l’absorption d’oxygène et la production consécutive d'acide carbonique.

MM. Bourquelot et Bertrand les ont retrouvées dans les champignons et beaucoup d’autres végétaux; l’un d'eux, à propos de la laccase, a signalé la propriété intéressante du manganèse dans les oxydations provoquées par ces ferments. Il à fait voir que ce métal, qui n’existe cependant qu’en très petite quantité chez les végétaux, paraît être l'agent réellement actif des oxydases, celui qui fonctionne comme activeur et convoyeur de l'oxygène; son rôle de co-ferment serait analogue à celui que jouent le calcium dans la pectase, ou l'acide dans la digestion pepsique.

D'après cela, l’auteur conçoit les oxydases comme des combinaisons spéciales du manganèse dans lesquelles le radical acide, sans doute de nature protéique et variable suivant le ferment considéré, aurait juste l’affinité nécessaire pour maintenir le métal en dissolution, c’est-à-dire sous la forme la plus propice au rôle qu’il doit remplir. Quoi qu'il en soit, ce métal semble pouvoir être remplacé dans certains cas par le fer, car j'ai trouvé chez certains végétaux, la feuille d’aconit en particulier, des oxydases assez actives qui ne contenaient pour ainsi dire pas de manganèse, mais au contraire une notable proportion de fer.

On verra plus loin que ce dernier métal pourrait bien être l'agent actif des substances oxydantes du règne animal, puisque c’est lui surtout qu’on y rencontre.

Ces ferments oxydants sont, comme la plupart des enzymes, solubles dans l’eau, précipitables par l’alcool, détruits par la chaleur et non dialysables. Leurs propriétés chimiques signalées plus haut permettent également de les caractériser ; je rappelle que les deux principales sont :

1° Un pouvoir oxydant qui doit se manifester en présence de l'oxygène gazeux ou dissous, mais libre;

— a 2° Cette action oxydante est toujours accompagnée d’une absorption d’oxygène.

MM. Abelous et Biarnès ont signalé de telles substances dans les organes et les tissus animaux, notamment chez les crustacés et les mammifères. Ces auteurs ont soumis les organes lavés (rate par exemple) ou la fibrine (veau, porc) à la digestion artificielle en présence de la papaïne ; le résidu inattaqué colorait la teinture de gaïac. Ce mème résidu, repris par une solution de nitrate de potasse à 8 pour 100 à la température de 40° pendant quelques jours, leur a donné un filtras qui bleuit également d’une manière intense la teinture de résine de gaïac.

La même liqueur étendue d’eau et traitée par un courant d'acide carbonique ou saturée de sulfate de magnésie donnant un précipité actif sur le gaïac, ils en conclurent que l'oxydase en question était une globuline.

Portier a étudié, lui aussi, les oxydases dans la série animale, ses expériences portèrent principalement sur la fibrine lavée et débarrassée des globules rouges. Elle était ensuite attaquée par le suc gastrique artificiel, par la trypsine en milieu neutre et en présence du fluorure de sodium ajouté à la dose de 2 pour 100, ou enfin simplement mise en macération à la température de 40° dans une solution fluorée. A l’exception de la digestion gastrique tous les filtrats étaient actifs dès le lendemain, sur la teinture de gaïac

Cette propriété disparaissait à l’ébullition ou au contact de l'air après quelques heures, à l’étuve l’activité diminuait également de jour en Jour.

M. Portier institua sur le sang différentes expériences qui, avec les précédentes, l’amenèrent à conclure que les globulines ne sont pas oxydantes pas plus que le stroma du globule rouge. Pour lui, l'oxydase serait localisée dans le leucocyte; la fibrine n’en étant Jamais totalement débarrassée, on s’expliquerait ainsi qu’elle puisse fournir des liqueurs actives vis-à-vis du gaïac. Cette oxydase pourrait être extraite par macération des leucocytes dans l’eau chloroformée ou fluorée à 2 pour 100 ou mieux par la digestion au moyen de la trypsine; l’auteur pense enfin qu'elle n’exisie pas chez l'animal

NL vivant, elle semblerait plutôt provenir de la destruction spontanée des leucocytes.

Bach, Rôühmann et Spitzer étudièrent aussi les matières oxydantes des tissus animaux. Les deux derniers utilisèrent, pour les caractériser, la synthèse d’une matière colorante dont la formation exige une oxydation. Ainsi, une liqueur composée d'une molécule d’x naphtol, d’une molécule de paraphénylènediamine et de trois molécules de soude, en solution très étendue, ne se colore en bleu, puis en violet qu'au bout d’un temps assez long, à la suite d’une oxydation lente provoquée par la soude; mais si on ajoute à la solution incolore une parcelle d’un organe frais, comme le foie privé de sang par le lavage, la coloration se produit en quelques minutes. Ce serait l'indice du pouvoir oxydant des organes.

En considérant les nombreux travaux suscités dans ces dernières années par les recherches de MM. Bourquelot et Bertrand, je croyais la question à peu près épuisée; mais, ainsi qu'on vient de le voir, la multiplicité des publications ne va pas toujours sans un certain nombre de faits contradictoires. En sorte qu’il était au moins utile d’en reprendre quelques-uns pour vérifier les résultats annoncés. Aujourd’hui, je n’ai pas à le regretter, car au cours de ces recherches j'ai rencontré plusieurs difficultés que je croyais élucidées et dont la solution m'a permis de découvrir des faits qui me paraissent intéressants.

J'ai donc répété sur tous les organes qui font l’objet de ce travail, les expériences de M. Abelous.

Les glandes ont été d’abord lavées pour les débarrasser du sang qu’elles contiennent, puis pulpées soigneusement et traitées par la papaïne ou la trypsine en milieu neutre à la température de 40°; après vingt-quatre heures, la liqueur était décantée et remplacée par une nouvelle solution du ferment digestif, au bout d’une période égale on recueillait le résidu insoluble qui était mis en macération soit dans le chlorure de sodium à 10 pour 100, ou l’azotate de potasse à 8 pour 100, toujours à la température de 40°. Après quelques jours, ja obtenu par filtration un liquide presque limpide qui a toujours été à peu près inactif sur la teinture fraîche de résine de

gaïac. Le résultat est aussi négatif avec des macérations aqueuses, glycérinées ou chlorurées, filtrées ou simplement décantées et par conséquent un peu troubles. Si, dans les liqueurs chlorurées, on précipite les globulines par le sulfate de magnésie à saturation, on obtient un coagulum également inactif sur le gaïac ou le gaïacol.

Certains auteurs ayant constaté que les portions de tissu inattaquables par la papaïne et la trypsine renfermaient une oxydase, j'avais pensé que le ferment était plutôt fixé sur les nucléines, mais les recherches dirigées dans ce sens n’ont pas abouti; d’ailleurs les nucléo-albumines et les nucléines ne bleuissent point la teinture de gaïac sans l'intervention de l’eau oxygénée.

Enfin, comme on pourrait objecter que l’action des agents oxydants sur les réactifs est annihilée ou masquée par la présence des matières extractives réductrices, les macérations aqueuses et chlorurées ont été précipitées par 4 à 5 volumes d'alcool à 90°. Après quelque temps, le coagulum séparé du liquide était lavé à l'alcool faible (70°) pour enlever les sels et les matières extractives, puis égoutté et délayé dans l’eau chloroformée salée; mais, au bout de deux jours de contact à la température de 40°, le produit filtré est resté sans action sur les réactifs habituels des oxydases.

Ces agents ne paraissent donc pas exister en quantité appréciable dans les organes que j'ai étudiés.

Les réactions obtenues sont, en effet, extrêmement faibles, lentes à se produire et, surtout, il n’y a jamais eu la plus petite absorption d’oxygène lorsque les solutions fermentaires ont été mises en présence de corps oxydables tels que l’hydroquinone, la pyrocatéchine, etc. IL n’y à guère que les macérations nitrées qui puissent bleuir légèrement la teinture de gaïac, mais ce fait n’est point suffisant, car M. Abelous lui-même a signalé récemment dans les tissus animaux l'existence de ferments réducteurs des nitrates; or les nitrites bleuissent le gaïac.

Mais, si l’on ne trouve pas les véritables oxydases, par contre, en présence de l’eau oxygénée, les réactions indiquées au moyen de la teinture de gaïac, du gaïacol et des autres

réactifs, sont toujours positives et le plus souvent fort intenses.

Dans ce cas, deux ordres de faits méritent d’être étudiés successivement :

1° La décomposition de l’eau oxygénée, qui se caractérise par un dégagement gazeux;

2° Les réactions oxydantes, qui peuvent avoir lieu simultanément.

Décomposition de l’eau oxygénée.

De tous les auteurs qui ont abordé ce problème, Jacobson, le premier, a déterminé les volumes d'oxygène mis en liberté par des macérés de pancréas et des solutions d’émulsine qu’il faisait agir sur l’eau oxygénée.

Pour cette étude, j'ai préparé des extraits organiques avec une partie de tissu pulpé et trois parties d’eau distillée thymolée ou un même volume de glycérine. Après un contact de douze heures, à la température ordinaire, je faisais réagir, dans un uréomètre à eau d’Yvon , deux centimètres cubes du liquide filtré sur deux centimètres cubes d’eau oxygénée parfaitement neutre et titrée chaque jour au moyen d’une solution de permanganate de potasse; le mélange était étendu d’une quantité d’eau distillée suffisante pour obtenir dans l'appareil un volume total de 15 centimètres cubes, de telle sorte que le liquide actif se trouvait toujours être au même degré de dilution.

Cette technique m'a servi également à déterminer l'influence exercée sur le dégagement d’oxygène par les alcalis et les acides. Dans ce cas, j'ai utilisé des solutions décinormales de potasse et d’acide chlorhydrique qui étaient ajoutées en quantités croissantes jusqu’au moment où toute réaction était supprimée.

Enfin, les volumes gazeux mesurés sur une solution saturée de chlorure de sodium pour éviter les pertes par dissolution de l'oxygène, ont été ramenés à la température de o° et à la pression de 760 millimètres.

Dans le tableau qui suit, une colonne a été réservée pour exprimer le volume d’oxygène dégagé pour 100; les rapports ont été obtenus en prenant pour base le volume d’oxygène que peut abandonner l'eau oxygénée lorsqu'elle est mise en contact avec une solution acide de permanganate de potasse. Pour obtenir le titre de cette eau, on opère de la façon suivante :

Le produit commercial étant neutralisé exactement par la soude étendue, on en mesure 1 centimètre cube qui est acidifié fortement par l’acide chlorhydrique pur (5 cent. cubes), après avoir ajouté 10 à 15 centimètres cubes d’eau, on y verse, au moyen d’une pipette graduée de Gay-Lussac, une solution de permanganate de potassium (à 5 gr. 659 par litre) jusqu’à coloration rose persistante; le nombre de centimètres cubes employés pour obtenir ce résultat représente le volume d’oxygène mis en liberté et qui se trouvait combiné à H°0.

Si on laisse de côté les ovaires, dont l’action est très faible, ces chiffres montrent que les extraits d'organes décomposent fortement l’eau oxygénée neutre, puisqu'ils peuvent dégager à peu près tout l'oxygène disponible, les moins énergiques. mettant encore en liberté 85 pour 100 environ de ce gaz.

On remarque aussi que les extraits glycérinés sont un peu plus actifs que les macérations aqueuses du même organe. En outre, contrairement à ce qui a été publié par M. Abelous, on voit qu’à l'exception des extraits hépatiques, les acides et les alcalis peuvent empêcher la décomposition d’avoir lieu, la quantité minima nécessaire variant d’ailleurs avec les organes. et le liquide extracteur; cependant on peut dire d’une manière générale qu’il faut de deux à quatre centimètres cubes d’acide: chlorhydrique décinormal et de cinq à dix centimètres cubes de potasse également décinormale pour ne plus obtenir de dégagement gazeux appréciable. Dans les conditions de mes expériences, ces volumes représentent exactement o gr. o6 d’acide chlorhydrique et o gr. 27 de potasse pour 100.

On doit noter également que les agents capables de décomposer l’eau oxygénée sont beaucoup plus sensibles à l’action des acides qu’à celle des alcalis. Enfin, ces réactifs n’ont pas le pouvoir de rendre l’eau oxygénée plus stable, leur influence s'exerce plutôt sur les matières albuminoïdes des extraits, car

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il faut laisser ces derniers en contact avec les alcalis ou les acides pour voir annihiler la décomposition; tandis que si on intervertit l’ordre et que l’on verse d’abord dans l’uréomètre l’alcali, par exemple, et l’eau oxygénée, puis en dernier lieu la macération organique, on observe encore un dégagement abondant d'oxygène.

Une température de 70° diminue notablement la quantité de gaz mIs en liberté et l’ébullition fait perdre à peu près complètement cette propriété.

On pouvait se demander si ces extraits agissent par la masse assez élevée des matières albuminoïdes qu’ils renferment à la dose de 15 à 20 grammes par litre; je me suis assuré qu'il n’en est rien par les expériences suivantes :

Si on additionne ces macérations de trois à quatre volumes d’alcool à 90°, le coagulum formé étant repris par une quantité d’eau distillée égale à celle du macéré employé, on obtient une solution capable de catalyser encore fortement l’eau oxygénée et cependant elle ne renferme plus qu’une très faible proportion de matières albuminoïdes, environ o gr. 50 à o gr. 75 par litre. Or un dixième et même un vingtième de centimètre cube de ces dernières liqueurs peuvent dégager presque autant d'oxygène que deux eentimètres cubes de la macération primitive.

Les organes qui, à cet égard, ont donné les liquides les plus actifs, après une ou deux précipitations alcooliques successives sont : le foie, la rate et le rein.

Le tableau suivant résume les principaux résultats obtenus avec deux centimètres cubes d’eau oxygénée.