CHAPITRE II

Essais physiologiques

« La véritable méthode pour l'étude « des médicaments, c’est la méthode « physiologique ».

HENRIJEAN Pharmacodynamie

Notions éénérales sur l'essai physioloéique des médicaments

La valeur commerciale d’un médicament est généralement déduite de la proportion du principe actif le plus abondant et le plus désigné à l'attention.

Si le renseignement donné par l'analyse chimique suffit généralement au but proposé, il ne suffit plus quand on veut évaluer l’action pharmacodynamique du médicament, surtout quand il s’agit d’un complexe extractif.

Avec les teintures et les extraits, en effet, l’action pharmacodynamique est fonction du bloc des principes immédiats soustraits à la plante et non d’un seul. C’est là, une vérité maintes fois énoncée et démontrée.

Pour cette raison, les résultats analytiques, si complets qu'ils soient, restent toujours d’une interprétation difficile quand il s’agit de les faire servir aux besoins de la thérapeutique. C’est de l’ensemble médicamenteux que lon escompte l'effet recherché et non d’un ou plusieurs de ses composants.

ADS

À propos des préparations d'Ergot de Seigle, TIFFE- NEAU (1) écrivait récemment que la complexité de cette drogue, la variabilité de sa composition, l’inégale activité des principes constituants « rendent illusoires toute tenta- « tive de dosage chimique. Les procédés d’extraction sont « inexacts, les méthodes colorimétriques sont peu sensibles « ou ne sont pas spécifiques. La standardisation physiolo- « gique est seule rationnelle. Elle permet de mesurer les « effets spécifiques de l’ensemble de l’Ergot ».

Cette conclusion s'applique encore à une foule d’autres médicaments qui, comme lErgot, ont une composition complexe ou mal connue. Chez de tels médicaments, les principes révélés à l'analyse, y sont aussi nombreux que variés, sans qu'on sache exactement auquel d’entre eux rapporter l’action physiologique.

Personne ne nie plus l'importance des essais physiologiques pour les médicaments. Ils ont soulevé d'importants débats au Congrès International de Pharmacie de la Haye en 1913 qui en a discuté longuement les méthodes et les résultats.

La Pharmacopée des Etats-Unis dans sa 9° édition (1916) a admis le titrage physiologique facultatif pour un certain nombre de ses teintures et de ses extraits. Les grandes maisons de droguerie l'utilisent comme contrôle de leurs essais chimiques. La Pharmacie Centrale de France, dès 1910, créaitun Laboratoire d'essais physiologiques pour contrôler l’activité d’un grand nombre de médicaments héroïques avant de les livrer à la'circulation.

(1) Tirrenrau. Sur les standardisations biologiques des préparations d'Ergot de Seigie. Bul. des Sciences Pharmacologiques, 4923.

Les laboratoires Dausse n’utilisent pour un grand nombre de médicaments galéniques que des poudres végétales d'activité constante ; activité déterminée par un essai physiologique.

Les services rendus par la méthode physiologique sont incontestables. Elle n’a contre elle, que la diversité des techniques employées qui enlève aux résultats l’uniformité qu'on aimerait y trouver. Mais pour une technique donnée, elle conserve toute sa valeur, surtout quand on ne lui demande que des résultats comparatifs. Ce n’est d’ailleurs que par l’emploi de techniques variées que l’on pourra dire quelle est la plus maniable et la plus sûre. Comme pour les essais chimiques, la fixité dans la méthode est des plus souhaitable.

Principales méthodes utilisées

Les méthodes utilisées pour les essais physiologiques diffèrent entre elles par plus d’un côté, dont les principaux sont :

1°) La nature de l’animal destiné à servir de réactif biologique.

2°) La voie d'introduction du médicament.

3°) La nature et la durée de la réaction biologique.

4°) L'’organe sur lequel est concentré l'observation.

Nous ne rappellerons ici que les deux méthodes les plus employées :

La méthode des doses léthales, d'emploi général.

La méthode du cœur de grenouille, d'emploi plus particulier.

Dans la méthode des doses léthales qui utilise généra-

nn

lement le Cobaye, le Lapin, le Rat blanc, la Souris blanche ou la Grenouille, on note la dose minimum du médicament essayé qui produit la mort de l'animal dans un temps donné : 1 heure pour le cobaye ; 1 000 secondes ou 10 minutes pour la grenouille. On rapporte les résultats soit à 1.000 gr. d'animal, soit à 100 gr., soit même à 1 gr. sil s’agit de la grenouille. Elle est applicable à tous les médicaments très actifs de quelque nature qu'ils soient.

C'est la méthode suivie par la Pharmacie Centrale de France (1) pour contrôler la toxicité des divers médicaments chimiques ou galéniques, alealoïdes ou glucosides, cocaïne, morphine, digitaline, strophantine, ete , etc.

C’est aussi la méthode suivie par les Etats-Unis pour les préparations d'Aconit (2). Ici, l'animal choisi est le cobaye, l'injection est sous-cutanée et la mort doit survenir en 12 heures. Le standard étant de O0 em° 0004 pour la teinture d’Aconit ; de 0 cm* 00004 pour l'extrait fluide ; on en déduit facilement que l'activité de ces deux préparations doit se trouver dans le rapport de 1 à 10. Ce seul exemple montre comment on peut établir les rapports d'activité ou plus exactement de toxicité de deux préparations héroïques.

La méthode du cœur de Grenouille s'applique plus spécialement aux médicaments toni-cardiaques tels que Digitale, Scille, Strophantus, Muguet, etc. Elle consiste à noter la dose minimum suffisante pour produire en un temps donné, non la mort réelle de l'animal, mais la mort fonctionnelle du cœur.

7 (4). Union pharmaceutique, 910, p. 560.

fi (2). Pharm. of the United States, ninth decennial édi. 1906, p.,

tee

Dans la méthode de FAMULENER ET Lyons (1) dite méthode d’une heure, le temps de l'arrêt systolique est d’une heure. Elle est mentionnée à la pharmacopée des Etats - Unis pour quelques médicaments digitaliques Digitale, Scille, Strophantus. Les doses léthales sont rapportées à 1 gr. d'animal.

Dans la méthode de FocKE (2) dite méthode brève, ce temps est de 9-11 minutes. De l'avis de beaucoup d’expérimentateurs, elle donne des résultats plus exacts que la première. Elle a été adoptée par Joan 8) avec quelques modifications, pour l’essai physiologique des poudres de Digitale.

La méthode physiologique a donné entre les mains d’expérimentateurs nombreux toute la mesure de ses avantages notamment avec la Digitale. C’est par son emploi raisonné que les pharmacodynamistes ont établi qu'il n'existe aucune corrélation entre la teneur en Digitaline d’une poudre de Digitale et son activité physiologique; et que d’autre part sa toxicité est toujours bien supérieure à celle de la Digitaline qu’elle contient (4). Ce qui revient à dire, ou bien que l’extraction de cette Digitaline par la méthode chimique n'est pas totale, ou bien qu’elle est accompagnée dans la plante de substances chimiques qui exaltent ses propriétés physiologiques.

(4). FauuLener anD Lyxons. Prac. Am. Pharm. Ass. Piladelph.

(2). Focxe. Die physiologische Wertbestimmung von Digilalisblatter. Arch. der pharm. 1902.

(3). Joan. Réactions biologiques, délerminisme experimental el essai biologique des médicaments. Bul. et Mem. Soc. Thérap. Paris, 1911, 4e ser. T. 16, p. 88-102.

(4). Pour le détail ; voir Bul. des Travaux du Lab. pharm. de Dausse,

Re

Quelle que soit l'interprétation adoptée, la valeur exacte de l’activité d’un médicament digitalique ne peut être rigoureusement fixée que par l'essai direct sur l’animal. GorrLieg (1) au Congrès allemand de médecine (1901) disait avec raison que la Digitale est un médicament si important qu'elle devrait être essayée comme les sérums, avant d’être délivrée.

Avec les préparations galéniques de Muguet, nous ne pouvions trouver meilleur sujet pour appliquer l'essai physiologique. Pour elle, comme pour la Digitale, lesméthodes chimiques ne peuvent fournir un critérium assez rigoureux de jeur activité. ZONDECK (2) a utilisé cette méthode expérimentale pour comparer l’activité de quelques préparations de Muguet.

Technique employée pour nos essais physioloéiques

Pour l'essai physiologique de nos préparations de Muguet nous avons utilisé une technique dont le principe tient à la fois de la méthode de Focke pour la brièveté de l'expérience et de la méthode d’une heure pour la notation des résultats.

Comme pour la méthode d’une heure, la toxicité des médicaments est déterminée par la dose minimum qui produit l'arrêt systolique du cœur et que pour cette raison nous préférons appeler dose cardiotoxique. Cette dose est ensuite rapportée à 100 gr. d'animal au lieu de 1 gr. comme aux États-Unis. Les résultats se trouvent

(4). D'après HENRIEAN. Pharmacodynamie, page 281. (2). Zonpeck. Zur phamalkologischen wertbestimmung der C. maïalis XIIT p. 217. 4rch. fur experim. path. und pharm. Leipzig, 1921,

ES ee

exprimés par une fraction décimale plus proche de l'unité, par suite plus facile à énoncer.

Comme dans la méthode de Focke, on cherche à obtenir la mort fonctionnelle du cœur dans un délai aussi voisin que possible de 10 minutes.

Les modifications que nous apportons aux méthodes déjà connues, ne sont pas de nature à fausser les résultats. Elles n’excluent ni la précision, ni l'obligation d'opérer dans des conditions identiques : deux qualités rigoureuses dans toute méthode expérimentale.

Au restant la méthode physiologique, ainsi que toutes les autres, exige cette sûreté de main et cette habitude qui pour un expérimentateur donné, rendent les observations plus égales. N’en est-il pas de même pour les analyses colorimétriques, polarimétriques ou chimiques ?

Les activités mesurées, étant surtout envisagées pour leur valeur relative plutôt que pour leur valeur absolue, il importe avant tout de rapporter ces activités à celles de médicaments cardiaques d’une composition invariable, choisie comme terme de comparaison : Ouabaïne, Digitaline crist. ou même poudre de Digitale d'activité définie.

La technique que nous allons décrire est critiquable au même titre que toutes les autres; mais par sa simplicité d'exécution, elle reste d’une vérification facile pour qui se proposerait de le faire.

Nous avons expérimenté sur la grenouille rousse (Z. temporaria). Cette espèce possède un cœur moins gros mais plus sensible à l’action des toni-cardiaques que celui de la grenouille verte (Z. esculenta). C’est d’ailleurs la seule que l'on puisse se procurer facilement pendant la période

d'hiver. Elle est la première à sortir du sommeil hivernal.

Nous n'avons utilisé que des individus mâles. Les femelles ont un cœur moins vigoureux, et leurs oviductes étant fréquemment gorgé d'œufs, le poids réel de l'animal se trouve très inégalement modifié.

De l'avis des pharmacodynamistes, le plus grave obstacle à la méthode serait la sensibilité variable des grenouilles aux poisons cardiaques suivant les saisons, les conditions d'alimentation et de température.

Comme eux, nous y avons paré dans la mesure du possible, en prenant les précautions suivantes :

1°) Nos expériences ont été faites durant une même saison (janvier-février) (1).

2°) Les grenouilles sont utilisées peu de temps après leur capture. Mises à stabuler 4 ou 5 jours dans des aquariums à la température de 18°-19°, elles achèvent de consommer les aliments absorbés. Cette sorte de jeûne préalable met la grenouille dans un état d’inanition partielle qui uniformise pour ainsi dire, leur puissance réactionnelle.

3) Les expériences sont toujours faites à 18°-19°.

4) Pour écarter le plus possible les divergences d'ordre individuel, nous n'avons utilisé que des individus de poids compris entre 22 gr. et 40 gr. Nous avons rejeté aussi tout animal dont le nombre de pulsations par minute est inférieur à 45 et supérieur à 60. L'expérience nous a montré

(f). Cette époque ou celle qui la précède est plus favorable aux expériences que celle qui lui fait suite. C'est au début du printemps que se l'ait l'accouplenent ; et ce dernier est de nature à influencer la résistance des individus mâles,

ho

que l'emploi des Grenouilles qui présentent des cas de brachycardie ou de trachycardie trop extrêmes, conduit à des résultats indignes d’être pris en considération.

Techrique de l’Injection

Les Grenouilles ainsi sélectionnées sont essuyées, pour enlever l’eau qui les imprègne, puis pesées à 50 centigrammes près (1).

L'animal est fixé sur un liège comme pour une dissection ; on incise la région sternale pour mettre le cœur à nu, avec son péricarde. L'ouverture est faite assez large pour dégager le cœur entièrement; mais juste suffisante pour éviter d’être gêné dans l'observation par les organes voisins : poumons, foie et intestins qui font facilement hernie. Enfin on évite les coups de ciseaux malencontreux qui pourraient provoquer un épanchement sanguin.

Celui-ci est non seulement des plus incommodants, mais il met l'animal dans un état de moindre résistance. De ce fait, la mort du cœur est généralement accélérée. Les

(1). Par 50 centigrammes près, nous entendons que dans toute pesée qui comporte une fraction inférieure à 50 cgr., celle-ci est négligée ; dans toute pesée qui comporte une fraction supérieure à 50 cgr. on compte 1 gr. en plus. La fraction de gramme comptée en excès ou en défaut n'excède pas 50 cgr. et l'erreur qui se trouve commise de ce fait, se trouve compensée par le jeu même de la formule employée (voir page 95):

ll nous paraît difficile de rechercher plus de précision dans la pesée de l'animal. Le volume injecté étant numériquement le 1/20° du poids de l'animal ; pour deux animaux présentant une différence de poids de 4 gr., les volumes à injecter présentent une différence de 1/20 de cm. 3. C'est le minimum qu'on puisse mesurer avec une seringue graduée au 1206,

Re.

résultats, obtenus dans ces conditions, ne peuvent être retenus (1).

Le péricarde est ensuite incisé délicatement ; et par des pressions latérales appropriées on fait saillir le cœur hors de la cage thoracique. On note alors le nombre de pulsations cardiaques ‘ce qui permet de rejeter les animaux ne présentant pas le rythme exigé.

Il convient d'ajouter que de la netteté et du soin apporté à cette petite opération chirurgicale sur la grenouille, dépend beaucoup le succès de l’expérience. Cette partie de la technique exige de l’opérateur beaucoup de dextérité qu’il ne peut acquérir qu'après un nombre respectable d'expériences exécutées sans profit immédiat.

L’'injection est faite par moitié dans les sacs lymphatiques de chaque cuisse postérieure avec une seringue de Pravaz de 2 em. * graduée au 1/20° de cm. * en notant avec soin l’heure de son exécution.

Elle doit être faite avec promptitude et sans perte de liquide. Là encore, l’habileté et la sûreté de main de l’opérateur sont en cause. Tout tâtonnement qui prolonge la

(1). Rappelons, à ce propos, que les premiers essais physiologiques furent sévèrement criliqués pour des raisons de ce genre, plus graves, il eat vrai. Dans les principes de thérapeutique (1884) FonssaGrrves signale que les expériences sur les animaux « s'accomplissent dans des conditions de traumatisme ou de perturbalion qui en altèrent la signification». Cette remarque s'adressait surtout aux expériences de Numrcv (4869) sur laction de la Sérychnine, de la Vératrine, de l'Aconiline, dela Morphine, etc. ainsi qu’à celles de Grasset Er AmBLarD (1889). Le cœur de grenouille était isolé puis immergé dans les solutions des substances à essayer et l'on étudiait la durée des pulsations. « Je ne crois pas, ajoute le juste critique, que [a paysiologie médicamenteuse tire jamais un grand profit d'essais inslitués dans des conditions si anormales et si violentes ».

to in

durée de l'injection, toute sortie de liquide hors de la seringue ou hors de la région injectée entache l'expérience d'irrégularité et rend les résultats inacceptables. L’'injection faite, il ne reste plus qu’à noter l’heure à laquelle se produit l'arrêt du cœur tel qu’il sera défini plus

loin.

Volume et dose injectés

Le volume du liquide injecté est toujours numériquement égal au 1/20° du poids de l'animal. De ce fait, la dose injectée se trouve elle-même dans un rapport constant avec le poids de l'animal. On admet ainsi, sans grande cause d'erreur, que la densité de la solution est celle de l’eau (1).

Le titre de la solution doit être suffisant pour que la mort du cœur se produise sensiblement au bout de 10 minutes (jamais moins de 930” jamais plus de 1030”), quelle que soit la nature du médicament injecté; soluté, teintures, extraits. Ce titre est indiqué par le nombre de milligrammes ou de grammes dissout dans 100 gr. de solvant.

Le temps de 10 minutes peut sembler court devant l'importance du volume de liquide injecté. Il suffit cependant à la résorption, et l'arrêt systolique n’en est que plus net. Mais c’est là, une valeur limite au-dessous de laquelle il serait imprudent de descendre sous peine d’enlever de la précision à la méthode.

Les solutions sont d’abord essayées à un titre aproché.

(1). Aux Etats-Unis, avec la méthode d'une heure, on injecte 0 mill. 0 15 par gr. de grenouille soit //67° environ du poids de l'animal.

Focke. puis JoaniN ,avec la méthode de 10 minutes injectent 1/40° du poids de l'animal.

En adoptant 1/20e le volume injecté est plus élevé, mais sa concentration est moindre, et les fuites légères de liquide par suintement ou de toute autre manière n’atteignent pas une aussi grande importance.

Toutes celles qui produisent l'arrêt systolique en moins de 10 minutes sont à un titre trop élevé. Toutes celles qui le produisent en plus de 10’ sont à un titre trop faible. Les premières doivent être diluées, les secondes concentrées. Il est préférable d’avoir à opérer une dilution plutôt qu'une concentration. Cette dernière opération nécessite une perte de temps et peut entraîner une modification desprincipesactifs.

Lorsque la réaction cardiaque ne se produit plus qu'avec un faible retard ou une faible avance sur le délai fixé, on achève de déterminer la dose cardiotoxique, non plus en remaniant le titre de la solution, mais en augmentant ou en diminuant Le volume injecté de 1/20° ou de 2/20° de cm. Cette variation dans le volume injecté n’est jamais faite que dans les limites extrêmes de 2/20° en plus ou en moins.

Par ce mécanisme, on achève de fixer la dose cardiotoxique sans toucher au titre de la solution ; de même qu'avec la vis micrométrique du microscope, on achève le règlage commencé avec ja crémaillère.

On devine aisément que ce n’est que par une série de tâtonnements que l’on peut établir la dose cardiotoxique pour une forme médicamenteuse donnée. Il est parfois nécessaire de sacrifier une vingtaine d'animaux ; mais ces tâtonnements sont réduits au minimum pour un expérimentateur exercé.

Lorsque la dose cardiotoxique a été ainsi établie, on procède à une sorte de vérification qui consiste à renouveler l'injection à 3 animaux, proportionnellement à leur poids et toujours dans les mêmes conditions de temps. Lamoyenne de l'arrêt systolique est calculée sur les résultats de ces 8 expériences de vérification et de celle qui précède (expé-

AD ir

riences décisives, où le titre de la solution a été arrêté fixé d’une façon immuable).

Calcul de la Dose cardiotoxique moyenne

Pour calculer la dose cardiotoxique moyenne rapportée à 100 gr. d'animal et au temps fixe de 10 minutes, il

ne reste plus qu’à appliquer la formule suivante :

De Te 10

p représentant le poids en milligr. de la substance contenue dans le volume injecté.

P représentant le poids en grammes de la grenouille utilisée pour l'expérience.

tn représentant le temps moyen de l'arrêt systolique e HLE LE )

Dans les cas, et ce sont les plus nombreux, où le volume

injecté n'est pas rectifié par addition ou soustraction de 1/20° ou de 2/20° de centimètre cube, il est avantageux de remplacer la formule précédente par la suivante :

4k 10 PROSTATE

T étant le nombre de milligrammes de substance con-

tenue dans 100 gr. de solution (1).

(1). La constante me X 100 représente en effet le poids en millgr. ou en gr. de la substance injectée à 100 gr. de grenouilles sous le volume 1}

de 5 cmÿ. Or ce poids équivaut à 50!

A la rigueur on pourrait même négliger le facteur RES 30 ! 30 sensiblement égal à 1, puisque t“ oscille entre 9° + “éd et 10° + “6. Nons l'avons fait cependant intervenir dans chaque expérience afin d'uniformiser plus parfaitement les résultats.

ms DD es Réaction cardiaque Convallamarinique

La réaction cardiaque que l’on observe après l'injection doit se terminer par l'arrêt franc du ventricule en systole. Ce terme de la réaction doit être constaté et noté avec autant d’exactitude que son début, lequel coïncide avec l'injection.

Dans nos expériences, nous n'avons retenu que le cas où l'arrêt systolique s’est montré remarquablement net. Il est toujours précédé d’une succession de troubles cardiaques, assez ressemblants à ceux de la réaction digitaiique décrite par LurGr SCOFONE (1).

Peu après l'injection, il se produit une augmentation très nette de la diastole ventriculaire, dûe à l’extensibilité de la fibre myocardique, sans modification de l’énergie systolique, ni du rythme.

Au bout de5 à 6 minutes, leventricule se dilateirrégulièrement et sa surface présente des mouvements d’ondulation. Ces mouvements ondulatoires, qualifiés de mouvements vermiculaires, sont dûs à ce que les fibres myocardiques se contractent confusément par groupes isolés. On ne peut dire que le rythme a disparu; il reste très observable. Le ventricule, d’un rouge uniforme au début devient bariolé. Sa surface présente des plages mobiles alternativement rouge-foncé et rose très clair.

Ces mouvementsondulatoires sont le signe précurseur de l'arrêt systolique du ventricule. Généralement celui-ei leur succède franchement. Si, dans l’ensemble, le ventricule

(1). Lula Scorone. Toxicilé comparée de la Digilaline sur quelques espèces animales. Trav. Lab. thérap. exp. Genève, 1893, p. 166-246.

continue à présenter quelques mouvements spasmodiques, en revanche la paroi ventriculaire devient incapable d’une nouvelle distension.

Tel est le tableau, le plus général, de l’intoxication convallamarinique.

Avec certains animaux, mais le fait est très rare, l'arrêt systolique se manifeste brusquement à la pointe du ventricule ; celle-ci est exsangue et contracturée ; la base au contraire, reste rouge et animée de contractions rythmiques Le rythme cardiaque étant conservé, le ventricule présentant à sa base des alternances de couleur claire et foncée qui traduisent une expulsion intermittente de sang, il n’est pas possible, à notre avis, de considérer ce phénomène comme le terme de la réaction cardiaque.

Avec quelques autres animaux, on observe assez fréquemment une variante. Entre le début de l'injection et l'arrêt définitif du ventricule, on observe le phénomène de dissociation auriculo-ventriculaire. La diastole ventriculaire se prolonge durant 2 ou 8 systoles auriculaires. Le ventricule reste quelque temps démesurément dilaté, gorgé de sang. Il reprend ensuite, ses contractions rythmées ou quelquefois se maintient dans cet état diastolique. L'arrêt fonctionnel se produit alors sans transition marquée.

Ce trouble dans la réaction cardiaque est généralement considéré comme l'indice d’un cœur peu musclé ou défaillant. Dans ce cas particulier, la mort est généralement plus longue à obtenir et nous ne faisons pas entrer l'expérience en ligne de compte,

En résumé: Le terme de réaction, l’arrêt systolique, doit se traduire par une contraction spasmodique, persis-

EE

tante, définitive; un aspect parfaitement exsangue du ventricule. Celui-ci n’expulse plus de sang, il est contracturé, absolument incapable d’une nouvelle diastole même partielle.

Tant qu'il persiste une plage ventriculaire, extensible rythmiquement, avee afflux de sang dans cette région nous considérons que leterme de la réaction n’est pas atteint. Enfin, si la réaction se manifeste d’une façon par trop différente de celle dont on a donné le tableau, les résultats ne sont pas consignés.