II. PHYSICO-CHIMIE DES PROTEINES

A. — Recherches sur la globine de l'hémoglobine

J’ai étudié les propriétés physico-chimiques de la globine, leurs variations au cours de la dégradation de cette protéine par action des acides, des bases, des protéases, et l’hydrolyse trypsi* que ou pepsique de ce corps .

Les travaux de R. Hill et R. Holden (1926) ont établi que la décomposition de l’hémoglobine par l’action des acides dilués conduit à la «globine dénaturée» (que je propose de nommer paraglobine, car elle ne présente pas les caractères des protéines «dénaturées))), si l’on opère à température ordinaire, tandis que la protéine résultant du même traitement de l’hémoglobine effectué à 0° est la «globine naturelle» (que j’appelerai simplement «globine»). La globine est apte à se combiner avec l’hématine alcaline pour régénérer la méthémoglobine, elle perd cette propriété en se transformant en paraglobine. L’exactitude de ces résultats une fois contrôlée, le but principal de mon travail a été de rechercher, si la disparition de la capacité de combinaison de la globine avec l’hématine lorsqu’elle se transforme en paraglobine se traduit par une modification des propriétés, de la protéine. Une telle constatation pourrait donner de précieuses indications sur les fonctions chimiques de la protéine qui, dans l’hémoglobine, entrent en combinaison avec le groupement prosthétique. J’ai dû, pour atteindre ce but étudier les propriétés physico-chimiques de la globine et de la paraglobine.

Dans une première partie de mon travail j’ai établi des méthodes de préparation de ces protéines qui permettent d’en obtenir des quantités importantes en solution concentrée. Ces méthodes largement inspirées de celles de Hill et Holden ont pour principe la décomposition de l’hémoglobine en globine par action d’une quantité minime d’acide chlorhydrique, l’élimination au moyen de Kieselguhr en milieu éthéré de l’hématine libérée, et la concentration de la protéine par précipitation au moyen du sulfate d’ammoniaque suivie de la dissolution du précipité dans la quantité minima d’eau. Ces manipulations faites dans une chambre refroidie à 0 0 , tous les liquides manipulés étant amenés à la limite de la congélation par immersion des récipients dans un bain de saumure à —10° environ, permettent d’obtenir la globine. En opérant à la température ordinaire, avec un petit excès d’acide chlorhydrique, on obtient la paraglobine.

a) Propriétés physico-chimiques de la globine et de la paraglobine.

La globine du porc a un point isoélectrique unique qui, déterminé par cataphorèse, est à pH= 7,5—7,6. La courbe de neutralisation de solutions de globine, établie au moyen de l’électrode d’antimoine (Vies et Vellinger) a permis de construire la courbe de pouvoir tampon de la globihe en fonction du pH. Cette dernière courbe présente deux minima, l’un de pH = 4 à pH = 5, l’autre, étroit, au point isoélectrique, à pH = 7.5. La globine ne présente pas de minimum de solubilité entre pH = 5 et pH= 10.

La paraglobine du porc a un point isoélectrique unique à pH = 7,6—7,8 (cataphorèse). Les courbes de neutralisation et de

pouvoir tampon de ses solutions présentent sensiblement la même allure que celles de la globine naturelle. Elle présente un minimum de solubilité (déterminé par dosage de l’azote dans la fraction soluble des échantillons placés 24 heures à température consstante, en solution pure de pH = 6.6 à 8.4 pour une concentration en protéine de 0.5 gr p. 100. Ces caractères sont constants dans des conditions d’observations déterminées. La variabilité du minimum de solubilité de la globine dans les diverses préparations, signalée par F. Haurowitz et H. Waelsch, tient à une dégradation de la protéine, de degré variable, au cours de leurs expériences.

Le fait que la globine possède un point isoélectrique plus élevé que celui de l’hémoglobine indique probablement que des fonctions basiques (—NH 2 ) de cette protéine sont combinées à i’hématine dans le pigment sanguin.

Les globines des divers mammifères ne présentent pas de différences accessibles aux techniques mises en oeuvre.

b) Variations des propriétés de la paraglobine sous Vinfluence de l’action des acides et des bases.

Une courte ébullition de la paraglobine en milieu acide (pH = 2 à 4) ne modifie si son point isoélectrique, ni sa solubilité. Au contraire, une courte ébullition à pH = 7,0, où la paraglobine est floculée, détermine une transformation irréversible de la protéine qui n’est plus alors soluble que dans des milieux fortement acides ou alcalins. C’est à cette protéine pratiquement insoluble qu’il vaut mieux réserver le nom de «globine ^ dénaturée». La zone de floculation irréversible, sous l’action

de la chaleur peut être élargie de plusieurs unités de pH par addition de sels neutres aux solutions. En milieu alcalin, une courte ébullition provoque en décalage du point isoélectrique pouvant passer de pH = 7,7 à pH = 6,6. Cette variation va de pair avec une augmentation du pouvoir tampon de la paraglobine, surtout marquée aux pH inférieurs à 9. Lorsque l’action de NaOH se prolonge, il y a mise en liberté de produits solubles (peptones ou polypeptides) et de petites quantités d’ammoniaque.

Toutes ces modifications s’effectuent également à la température ordinaire, mais dans un temps plus long. Ce sont elles qui ont fait croire à Haurowitz et Waelsch que la paraglobine ne présentait pas toujours le même minimum de solubilité.

c) Action des protéases sur la paraglobine.

La pepsine a un optium d’action sur la paraglobine à pH = 2,2, et la trypsine à pH = 8,2, et cela contrairement aux données établies par Northrop, pour qui l’action de la trypsine sur la globine ne comporte pas l’optimum.

La trypsine n’agit sur la paraglobine qu’en présence de kinase.

L’action de la pepsine sur la paraglobine libère de -COOH (titrés selon Willstatter) et des -NN 2 (titrés selon Van Slyke) en -COOH libérés . .

quantité telle que le rapport :— N|-j 2 libér és" GSt v ° 1Sin “ e '

Cette action doit donc se borner à l’hydrolyse de liaisons du type peptidique. Pareille observation a été faite antérieure-

ment par de nombreux auteurs, en particulier par S. P. L, Sôrensen et L. Katschioni-Walther dans le cas de l’action de la pepsine sur des protéines du groupe des albumines et par K. Félix et A. Harteneck lors de la digestion pepsique de la thymohistone.

Le premier temps de l’action de la pepsine et de la trypsine sur la paraglobine détermine des modifications de cette protéine se traduisant par une variation du point isoélectrique vers les pH acides. On note en effet, au début de l’action des protéases étudiées un déplacement du minimum de solubilité de la protéine vers les pH bas. Ce décalage peut porter, dans les cas extrêmes sur deux unités de pH.

Ce phénomène, de même ordre que celui noté dans l’action de l’ion OH - sur la paraglobine suggère l’idée que les hydrolyses alcaline et enzymatique doivent, à leur début, s’effectuer suivant un mécanisme identique. Étant donné que dans le cas de l’hydrolyse pepsique tout au moins, il est concomitant à une libération de —COOH et de —NH 2 en nombre égal, il signifie que les COOH libérés sont plus fortement dissociés que les fonctions basiques simultanément libérées.