SÉPARATION DE LA LACCASE ET DE LA TYROISNASE

Séparation de la laccase et de la tyrosinase par la chaleur

441. Les macérations glycérinées de champignons renferment à la fois de la laccase et de la tyrosinase. Il est facile de séparer ces deux diastases par l’action de la chaleur, qui détruit facilement la tyrosinase, tandis que la laccase est très résistante. La température mortelle de la tyrosinase varie un peu, suivant son origine ; c’est ainsi que celle du champignon découché est détruite par un chaufl’agede trois minutes à 63-70“, celle de Russula quelelti à 70-73®, et la tyrosinase du son seulement à 90-95®.

442. — Pour faire la séparation des oxydases contenues dans une macération glycérinée, on prend une série de tubes à essai et on introduit 1 centimètre cube de macération dans chacun des tubes. On plonge trois de ces tubes dans l’eau d’un bain-marie chauffé à 63® et, lorsque la température du liquide diastasique, prise au moyen d’un thermomètre placé dans l’un des tubes, atteint ce degré, on compte exactement trois minutes.

On retire les tubes et on y verse respectivement 10 centimètres cubes de solution de tyrosine à 0,1 “/o 10 centimètres cubes de gaïacol à 1 “/i, et un mélange de 2 centimètres cubes de teinture de ga'iac avec quatre volumes d’eau. On voit que le premier mélange ne se colore plus, ou donne seulement une fail)le coloration rose, les deux autres se colorant respectivement en rouge et en bleu.

OXYDASIiS

Si la tyi’osinase n’élait pas tolalemenl délruile dans ces condilions, on recommencerait l’expérience, après avoir élevé la température du bain-marie à 70'^; et ainsi de suite, jusqu’à ce que le tube contenant la tyrosine ne se colore plus. La macération ainsi chauffée donne toujours les réactions colorées avec le gaïacol et le gaïac, ce qui démontre la plus grande résistance de la laccase à la chaleur.

Recherche exacte des oxydases

443. — Le caractère fondamental des oxydases étant de fixer l’oxygène de l’air sur les corps oxydables, leur recherche doit être basée sur l’existence de ce caractère.

Pour rechercher la présence des oxydases dans un extrait animal ou végétal, on utilise un petit appareil formé d'un tube analogue à un tube à essai, portant deux étranglements E et E' et auquel est soudé un tube plus étroit A terminé par une petite boule {fi(j. 42).

On place quelques gouttes de la solution étudiée dans le tube A, et 5 centimètres cubes d’un corps oxydable, gaïacol à 1 % tyrosine à 0,1 "/o, par exemple, dans le tube B. On fixe alors sur celui-ci, au moyen d’un anneau de cire Golaz, un capuchon de verre G portant un tube d’environ 20 centimètres de long, étiré en d en une effilure à parois épaisses.

L’appareil étant ainsi préparé, on le met en relation avec un tube en d’ dont l’une des branches est en relation avec une bonne trompe à eau, et l’autre avec un appai’eil à anhydride carbonique. On fait le vide, puis

RECHËRCIIË exacte DËâ OXYDASES 34o

inleiTompant la communication avec la trompe, on laisse rentrer dans l’appareil du gaz carbonique ; on agite un instant, pour saturer le liquide, puis on ferme

Fig. 42. — Recherche des oxydases.

le robinet de l’appai^eil et on fait de nouveau le vide. On renouvelle cette manœuvre trois à quatre fois, afin de purger complètement l’appareil de l’oxygène qu’il renferme. (Si on dispose d’une trompe à mercure, on peut se contenter d’un seul lavage avec le gaz carbonique.) Finalement on fait le vide aussi complètement

PEROXYDIASTASE

que possible, et on scelle le lube en cbaufTanl, à l’aide d’une petite flamme, l’effilure cl.

Si on retourne l’appareil, de manière à mélanger le contenu des tubes A et B, il ne se produit aucune coloration, même après plusieurs jours. Si on brise alors la pointe effilée, de manière à laisser entrer l’air, le liquide se colore peu à peu, dans le cas de la présence d’une oxydase (laccase agissant sur le gaïacol ou tyrosinase sur la tyrosine).

APPENDICE

PEROXYDIASTASE

Réaction peroxydiastasique du sang

444. — L’hémoglobine du sang agit en présence d’eau oxygénée H-0-^ comme la laccase en pi’ésence de l’oxygène de l’air, de sorte qu’un mélange de cette substance et d’eau oxygénée donne toutes les réactions colorées de la laccase.

Dans un liquide où on soupçonne la présence de sang, on peut essayer de produire 1a réaction peroxydiastasi([ue de la manière suivante. A 10 centimètres cubes du liquide on ajoute 1 centimètre cube de teinture fraîche de gaïac : l’émulsion reste d’un blanc lai-

DIFFÉnENGIATlON DU LAIT CRU ET BOUILLI 347

leux. Mais si on ajoute une seule gouLle d’eau oxygénée neutralisée ('), on voit se développer une coloration bleu indigo qui est un des caractères indiquant la présence possible du sang.

Application des propriétés peroxydiastasiques

à la différenciation du lait cru et du lait bouilli

445. — Le lait possède une légère réaction peroxydiastasique qui disparaît lorsqu’on le porte à l’ébullition, d’où un moyen de distinguer le lait bouilli du lait cru.

Dans quatre tubes à essai, on verse 10 centimètres cubes de lait; deux de ces tubes sont ensuite portés à l’ébullition pendant trente secondes, puis refroidis. Le refroidissement doit être complet, car le lait bouilli encore chaud donne les mêmes colorations que le lait cru.

Dans un tube de lait cru et un tube de lait bouilli, mettre de teinture fraîche degaïac ; il ne se pro-

duit rien. Si oïl ajoute une seule goutte d’eau oxygénée neutralisée (à 4 ou 5 volumes au plus), il se développe

(>) 11 est indispensable, avec la peroxydiastase ou la catalase, d’opérer toujours avec de l'eau oxygénée neutralisée. On prépare celle-ci en ajoutant à de l’eau oxygénée commerciale, à 10-12 volumes, toujours très acide, de l'eau de baryte jusqu'à réaction à peine alcaline; on réacidilie aussitôt très légèrement par une seule goutte d’aciile sull'urique et on filtre pour enlever l'abondant précipité blanc de sulfate ou de pbospbate de baryum.

Lorsque l’acidité de l’eau oxygénée est due à l’acide borique, il n'est pas nécessaire de la neutraliser, cet acide n'exerçant pas d’action empêchante sur les diastases considérées.

l'EROXVUIASïASË

une coloration bleue clans le lait cru, le lait bouilli restant parlaiteinent blanc.

La réaction est plus nette si on emploie un mélange de teinture de gaïac avec un peu de gaïacol. En ajoutant à 10 centimètres cubes de lait de teinture

de gaïac et deux gouttes de solution alcoolique de gaïacol à 5 on a immédiatement une coloration bleu foncé.

Dans les deux autres tubes, on verse 4 à 5 centimètres cubes de solution de gaïacol à 1 "/o. qui ne les colore pas, puis une goutte d’eau oxygénée. Le tube de lait cru se colore en rose, l’autre restant blanc.

On peut vérifier que le lait cru se colore en bleu lorsqu’on lui ajoute de la teinture de gaïac ancienne qui est toujours peroxydée, sans qu’il soit besoin d’introduire d’eau oxygénée.

Recherche des peroxydiastases en présence des oxydases

446. — Pour faire cette recherche, on emploie l’appareil décrit § 443, en plaçant dans le tube A la solution à examiner, et dans le tube B quelques centimètres cubes de solution de gaïacol avec 1 goutte d’eau oxygénée pure. Ou fait le vide comme il a été indiqué, puis ou retourne l’appareil pour mélanger les liquides. S’il y a une peroxydiastase, la coloration rouge apparaît bientôt en l'absence de l’air; elle correspond, en effet, à un phénomène d’oxydation (|ui est dô, non pas à l’oxygène de l’air, mais à l’oxygène atomicjue libéré de l’eau o.xygénée.