MILIEUX DE CULTURE

lion, enfin, les caractères particuliers de chaque fermenlalion.

Il conviendra, dans celle étude, de faire une place à part aux espèces anaérobies, qui exigent une technique particulière.

Milieux de culture

457. — Les milieux de culture peuvent être liquides ou solides. Comme milieux liquides, on emploie des dissolutions contenant de petites quantités de sels minéraux, chlorure de sodium, phosphates, etc., et des substances organiques, sucres, substances protéiques, etc. On emploie beaucoup le bouillon de viande, les décoctions delevure ou de touraillons, additionnés ou non de divers corps nutritifs, glycérine, sucre, peptone, etc.

Habituellement, pour entretenir les cultures, on utilise des tubes à essai ordinaires, contenant 10 à 15 centimètres cubes de milieu liquide. Celui-ci est introduit commodément au moyen d’un entonnoir de 250 à 500 centimètres cubes de capacité, dont la douille porte un tube de caoutchouc de quelques centimètres de longueur, pouvant être obturé au moyen d’une pince de Mohr et muni d’un ajutage de verre étiré. Le tube garni de liquide est ensuite bouché à l’aide d’un tamjion d’ouate et stérilisé comme il est indiqué § 459.

458. — Les milieux solides peuvent être formés en solidifiant les liquides précédentsau moyen de gélatine ou de gélose ; par exemple, on y dissout, en chaulfant

à l’ébullilion, 10 à 15 *•/„ de gélatine ou 1 ,5*7o de gélose. Le liquide doit être préalablement neutralisé, la propriété gélifiante de ces substances disparaissant par cbaulïage en milieu trop acide. On peut clarifier le milieu en y introduisant, api’ès refroidissement à iO”, un peu de blanc d’œuf, et portant de nouveau à l’ébullition. Si la coagulation se fait mal, on ajoute goutte à goutte au liquide de l’acide acétique dilué jusqu’à réaction très légèrement acide au papier de tournesol. La clarification étant obtenue, on neutralise à nouveau, si cela est nécessaire, ou même on produit une légère alcalinité par addition de quelques gouttes de soude étendue. Le liquide filtré à chaud est réparti rapidement dans des tubes à essai, au moyen du dispositif indiqué ci-dessus ; on bouche à l’ouate et on stérilise.

Lorsque l’on veut donner une grande surface au milieu solide, on n’introduit dans les tubes que 4 à 3 centimètres cubes de ce milieu, puis on les incline presque horizontalement, aussitôt après les avoir retirés de l’autoclave, en ayant soin qne le tampon d’ouate ne soit pas mouillé par le liquide, et on les abandonne au refroidissement. On a ainsi des tubes de gélatine ou de gélose dite inclinée.

On peut aussi employer comme milieux solides des substances protéiques (blanc d’œuf, sérum), coagulées par la chaleur, ou des tranches de divers légumes (pomme de terre, carotte, etc.).

Les milieux solides peuvent être protégés contre la dessiccation par l’emploi de capuchons de caoutchouc, stérilisés à part, et placés sur les tubes ipii doivent être conservés quebpie temps.

La composition des milieux variant avec les espèces

STÉniLISATlON A l'aUTOCLAVE

microbiennes, on indiquera à propos de chaque fermen talion les formules qu’il convient d'employer.

Stérilisation à l’autoclave

459. — Ces divers milieux, solides ou liquides, sont débarrassés de germes vivants ou, comme on dit, stérilisés^ par divers moyens. Le chauffage dans la vapeur d’eau sous pression est le procédé le plus général ; une température de 110“ maintenue pendant trente minutes, de 115" pendant vingt minutes, ou de 120“ pendant quinze minutes, suffit d’ordinaire pour stériliser tous les milieux. Ce chauffage s’effectue dans un autoclave, constitué par une marmite de Papin en bronze, contenant de l’eau. A l’intérieur se trouve un panier en toile métallique dans lequel se placent les objets à stériliser ; l’appareil est muni d’un couvercle auquel sont adaptés un robinet, un manomètre et une soupape de sûreté.

Pour se servir de l'autoclave, verser dans la chaudière une quantité d’eau suffisante pour que le niveau arrive un peu au-dessous du fond du panier métallique ; introduire celui-ci, après y avoir disposé les vases contenant les milieux à stériliser (ces vases sont bouchés avec un tampon d’ouate recouvert d'une double feuille de papier à fdlrer assujettie avec une ficelle). On dispose alors le couvercle, et on le fixe à l’aide des écrous, que l’on serre très modérément, à la main, de façon à ne pas écraser l’anneau de caoutchouc interposé. Le robinet de vapeur étant ouvei't, on cbaufi'e, puis on attend ([ue l’air soit expulsé par la vapeur d’eau. On reconnaît

que ce résuIlaL est obtenu parfois à la différence des sons que produisent l’air et la vapeur en soufflant par le robinet, mais surtout à l’aspect du jet gazeux. Tant que celui-ci est formé par un mélange d’air et de vapeur, le nuage produit par condensation varie sans cesse d’aspect ; ce nuage prend une opacité constante dès que tout l’air est expulsé. A ce moment on ferme le robinet, et on attend que l’aiguille du manomètre marque la température désirée ('). Dès que celle-ci est atteinte, il faut la maintenir constante en diminuant convenablement la hauteur de la flamme.

Après un chaulïage de durée suffisante (jiendanl lequel on doit surveiller très fréquemment le manomètre), on éteint le feu et on laisse refroidir. Lorsque l’aiguille du manomètre est revenue au zéro, et seulement à ce moment, on ouvre avec précaution le robinet de vapeur, puis on desserre les écrous et on enlève le couvercle.

Préparation et stérilisation des pipettes Pasteur

460. — On coupe, au moyen d’un couteau à verre, des fragments de tubes de verre de 20 à 25 centimètres de longueur. Le diamètre le plus convenable est de 7 à 8 millimètres. On arrondit les extrémités en les (lambantau chalumeau, puis, après refroidissement, on introduit aux deux extrémités des tampons d’oua! te assez

(1) Si, pendant ce temps, il se produit une fuite de vapeur en un point quelconque de la circonférence du couvercle, on larrôte eu resserrant légèrement les écrous correspondants soit à la main, soit à l'aide d’une clé.

ENSEMEiNCEMKNT DES MILIEUX DE CULTURE 3f)i

serrés, de 2 centimètres environ de longueur, qui ne doivent pas déborder. Cette opération se fait très bien en poussant les tampons avec un morceau de gros fil deferou unfragmentde baguette de verre effilé. Lorsque les tubes sont garnis d’ouate, on les stérilise en les plaçant dans une étuve à air chaud, en tôle, dans laquelle on les porte à la température de 180“ pendant quinze minutes. Si la stérilisation est suffisante, les cotons doivent être légèrement roussis, à peine teintés de jaune clair. Après refroidissement, on conserve les tubes dans cetétat.

On peut également stériliserles pipettes en lescbauffant à l’autoclave vers 120”, par exemple, mais il faut alors les laisser sécher à l’étuve avant de s’en servir.

Lorsqu’on a besoin de pipettes stériles, on chauffe l’un de ces tubes par le milieu en le tournant sans cesse dans la flamme du chalumeau ; quand le verre est bien ramolli, on retire de la (lamme et on étire, de manière à avoir une partie effilée de 40 à 50 centimètres de longueur, pas trop mince. On coupe celte effilure au milieu en la fondant au bord de la flamme, et on a deux pipettes stériles, dont il suffit de briser la pointe après refroidissement, au moment d’en faire usage.

Ensemencement des milieux de culture

461. — Cette opération a pour but de porter une semence dans un milieu de culture stérile, en évitant la contamination par les germes étrangers. On devra donc porter la .semence, soit avec une jiipctte stérile, soit avec un fil de platine préalablement porté au

NOTIONS DE TECHNIQUE MICHOBlOEOfilOUE

rouge, puis refroidi, et éviter rintroduction des germes de l’air, en particulier.

Dans ce but, on maintient loujours, autant que po.ssible, les tubes à essai ou les cols des ballons inclinés au moment où on les débouche; on flambe leur ouverture avant de les reboucher pour ne pas y introduire d’impuretés en replaçant le tampon d’ouate ; ce dernier ne doit pas être posé pendant l’opération, mais tenu de manière à éviter tout contact à la partie qui pénètre dans l’intérieur du tube ; enfin, on doit llamber, après l’avoir brisée, l’effilure des pipettes Pasteur destinées à prélever et à transporter la semence. On évite ainsi la contamination par les germes qui auraient pu se déposer sur les effilures.

L’opération doit être faite, de préférence, dans une pièce où l’air est au repos, en faisant le moins possible de mouvements capables de mettre les poussières en suspension.

Une bonne précaution consiste à recouvrir, après l’ensemencement, le coton qui ferme le col des ballons ou l’ouverture des tubes avec un capuchon formé d'un double de papier à filtrer ; ce capuchon peut être assuré au besoin par une ligature.

Séparation et isolement des germes

462. — Cette opération permet d’obtenir des cultures pures des espèces microbiennes que l’on désire étudier. Elle peut être réalisée soit par un procédé mécanique, soit en se basant sur une propriété physiologique de l’espèce étudiée, telle que la résistance à la chaleur, par exemple.