SÉPARATION ET ISOLEMENT DES GERMES

On réalise la séparation mécanique des germes de la manière suivante :

On utilise un fil de platine assez gros, emmanché sur un agitateur, ou bien une simple effilure de verre, obtenue en étirant une baguette à son extrémité. On llambe l’instrument, on le laisse refroidir et on prélève avec son extrémité un peu de mélange à séparer, que l’on porte dans l’intérieur d’un tube de gélose incliné. L’extrémité du fil est appliquée sur la gélose au fond du tube, et on la ramène vers l’ouverture par un mouvement en zigzag de manière à l’essuyer en quelque sorte à la surface du milieu nutritif. On recommence dans un deuxième, puis un troisième tube, sans reprendre de semence. Les ouvertures des tubes sont aussitôt flambées, puis bouchées. On débarrasse ainsi peu à peu le fil de platine ou de verre des germes qu’il portait; ceux-ci'^sont étalés à la surface de la gélose, séparés et disséminés, et, après séjour convenable des tubes à l’étuve à 35®, on trouvera sur la gélose des colonies plus ou moins isolées, produites par le développement des germes. Il suffira de prélever ces colonies à l’aide d’une pipette de verre effilée, et de les ensemencer sur un milieu stérile.

Les colonies auront été au préalable examinées au microscope à un très faible grossissement (objectif 1 ou 2), de manière à ce que l’on puisse reconnaître celles qui appartiennent à une même espèce et qui sont toutes semblables entre elles. On devra se rappeler que des colonies, môme très homogènes en apparence, peuvent être formées de deux espèces microbiennes associées; on le reconnaîtra, le plus souvent, à l’examen au microscope.

ün peut également se contenter de tremper le fil de platine portant la semence dans l’eau qui se condense toujours au fond des tubes de gélose; on le plonge ainsi successivement sans le recharger dans l’eau de condensation de trois à quatre de ces tubes, en l’agitant bien pour dissocier et délayer les germes; on incline ensuite chaque tube pour faire couler le liijuide à la surface de la gélose. Lorsqu’il s’est étalé uniformément, on redresse les tubes et on les place à l’étuve à 35“.

Fio. 43. — Hacillus subtilis.

A. Cullui’e jeune. — B. Bord du voile.

463. — Une deuxième mélhode de séparation est celle qui repose sur la résistance à la chaleur d une espece donnée ou de ses spores, ün peut 1 appliquci par exemple à l’isolement du Bacillus subtilis.

Les spores de cette espèce, très répandues à la surface du sol el sur les fourrages, résistent à une température de lüü“ prolongée pendant assez longtemps ;

ISOLEMENT DES ANAÉROBIES

celle lempéralure délmil lous les microorg-anismes à l’élal végélalif. On peul donc oblenir une culture pure de B. suhtilis en opéranl de la manière suivanle :

On fait infuser dans une capsule de porcelaine un peu de foin desséché avec une quantité d’eau chaude suffisante pour le recouvrir, pendant une demi-heure. On filtre le liquide dans un matras que l’on houche avec un tampon d’ouate et on porte à l’éhullition pendant au moins un quart d’heure. On laisse refroidir, puis on porte à l’étuve à 33”; après vingt-quatre à quarante-huit heures, le liquide est couvert d’un voile mince dû à B. subtiUs. On examinera au microscope, d’une part un fragment du voile, de l’autre, une goutte du liquide renfermant encore de petits bacilles très mobiles souvent fixés bout à bout et donnant des filaments plus ou moins longs {fig. 13).

Isolement des anaérobies

464. — On réalise l’isolement des microbes anaérobies le plus commodément par la méthode suivante (Veillon et Zuber).

On prépare d’abord une macération de 250 grammes de viande dégraissée et hachée dans 500 centimètres cubes d’eau. On abandonne deux ou trois jours, |)uis on passe à - travers une mousseline et on ajoute 5 grammes de peptone et 2s'’,5 de chlorure de sodium. On chaulTe légèrement en agitant, et lorscjue la dissolution est obtenue, on introduit 6 grammes de gélose coupée en petits fragments, puis assez de soude à 10"/„ pour (pie le liquide bleuisse nettement le papier de tournesol. On chaufTe alors à l'autoclave, à 120”, pen-

daiiL une demi-heure. Le liquide visqueux est refroidi ensuite à S0“, et on y ajoute la moitié d’un blanc d’œuf battu dans un peu d’eau où on a fait dissoudre 7 à 8 grammes de glucose. Le mélange bien remué est porté de nouveau à 120'’ pendant quinze minutes. Le liquide bouillant, versé sur un filtre en papier Chardin, doit passer rapidement et très clair. On le répartit aussitôt dans des tubes à essai, au moyen du dispositif décrit (§ 457b de manière à ce que chaque tube soit rempli jusqu’à une hauteur de 10 centimètres environ; on bouche à l’ouate et on stérilise par chauffage de quinze minutes à 115°.

465. — Pour isoler les anaérobies contenus dans le sol. par exemple, on délaie une pincée de terre de jardin dans 10 à 13 centimètres cubes d’eau et on laisse déposer. On plonge d’autre part cinq à six tubes de gélose (préparée comme ci-dessus) dans de l’eau bouillante, de manière à liquéfier complètement la masse, puis on les retire après cinq à dix minutes et on les maintient à 40“ dans un bain-marie. Ils restent ainsi à l'état liquide, sans que la température soit mortelle pour les bactéries.

On ensemence ensuite de la manière suivante : on prend une pipette Pasteur à longue effilurc, fermée, on s’en sert pour prélever une gouttelette de l’eau de lavage de terre, et on l’enfonce dans le premier tube de gélose fondue, en remuant de manière à bien mélanger. La pipette étant retirée de ce tube, est plongée dans un second, sans être rechargée de semence ; on agite bien, on recommence avec un troisième tube, et ainsi de suite. Toutes ces opérations sont faites aveç les précautions d’asep.sic

ISOLEMENT DES ANAEROBIES

On obliont ainsi des lubes de gélose dans lesquels la semence est diluée progressivement et où les microbes sont de plus en plus disséminés et rares. Les lubes ensemencés sont plongés aussi Loi dans l’eau froide, de manière à ce que la gélose solidifiée maintienne chaque germe à sa place. Les lubes éliquetés sont alors mis à l’éluveà 33“-37°.

Si les tubes ont été bien purgés d’air par chauffage à 100®, ils contiennent peu d'oxygène ; la pénétration se fait par la surface, lentement, et ne dépasse guère 1 à 2 centimètres. Dans cette zone aérée supérieure pourront se développer des aérobies, tandis que les anaérobies pousseront dans la zone profonde. Les microbes donnent naissance à des colonies que l’on voit apparaître peu à peu sous forme de points d’aspects divers.

Ces colonies, nombreuses dans les premiers tubes, doivent être rares et bien isolées dans les derniers. On peut facilement les examiner aux faibles grossissements du microscope.

Pour les isoler, il faut repérer d’un point à l’encre la colonie que l’on désire, et la prendre avec une pipette à longue effilure que l’on a llambée après en avoir brisé la pointe. Le tube étant placé horizontalement, on pique la pointe dans la gélose, jusqu’à ce qu’elle touche la colonie voulue ; on aspire alors légèrement au moyen d’un tube de caoutchouc fixé à la Iiipcttc, et on fait pénétrer dans celle-ci tout ou partie de la colonie. On retire la pipette en évitant de toucher les colonies voisines, et on réensemence dans le milieu choisi en y .soufllant légèrement la colonie isolée.

La plupart des espèces anaérobies donpent heu, sur-

3()8 NOTIONS DE TECHNIQUE MICnOBIOLOGIQUE

loul en présence du sucre, à un dégagement gazeux qui Iragmente et désagège le milieu solide; on peut empêcher ce dégagement dans la plupart des cas, en ajoutant au milieu de culture 0,1 de nitrate de potassium.

Fixation et coloration des microbes

466. — Pour observer les bactéries avec leur aspect réel, il est indispensable de les examiner au microscope à l'état vivant; on peut ainsi déterminer leur l'orme, leurs dimensions, apprécier leur motilité, etc. Cet examen se fait facilement, en déposant sur une lame porte-objet unegouttcde cultureen milieu liquide, recouvrant d’une lamelle, et portant sur la platine du microscope. Lorsqu’il s’agit d’une culture sur milieu solide, on délaie une parcelle de celle-ci dans une goutte d’eau placée sur la lame, puis on recouvre et on examine. On doit employer, pour l’examen des microbes vivants, un éclairage bien réglé, un excès de lumière pouvant empêcher complètement de les apercevoir.

On obtient aussi de très bons résultats en les observant dans l’éclairage sur fond noir de l’ultramicroscope.

Pour examiner les cultures des espèces anaérobies, on dépose la lamelle avec précaution sur la goutte liquide, en évitant la formation do bulles d’air. On fait tomber sur les quatre angles de la lamelle une goutte de parafline fondue, et on étale celle-ci avec un fragment de fil de fer recourbé légèrement chautTé, de manière à border la lamelle et à empêcher le contact de l’air avec la préparation.