FIXATION ET COLOHATION DES MICROBES

Les bactéries, d’abord immobilisées, reprennent peu à peu toute la vivacité de leurs mouvements.

467. — Lorsqu’on veut déceler la présence des bactéries dans des tissus ou parmi des fragments de subslances inertes, ou apercevoir des détails de structure, il est préférable de procéder à leur coloration. Celle-ci facilite d’ailleurs dans tous les cas la recherche et l’examen des microbes.

On commence par poser sur une lame bien propre (nettoyée au moyen d’un linge fin imbibé d’eau ammoniacale) une goutte, soit de la suspension microbienne à étudier, obtenue par agitation avec de l’eau, soit du milieu de culture, comme pour l’examen à l’état frais ; on étale cette goutte en mince couche sur une surface de 1 à 2 centimètres carrés et on laisse sécher à l’air. Quand la dessiccation est obtenue, on procède à l’opération dite fixation^ qui a pour but de fixer la forme et la structure des éléments cellulaires, et en même temps les fait adhérer assez étroitement au support pour que les lavages et les traitements ultérieurs ne puissent les en détacher.

Pour iixer, on recouvre la lame de quelques gouttes d’un mélange à parties égales d’alcool à 96° et d’éther ordinaire; on jette ce liejuide, on verse à nouveau quelques gouttes du même mélange, puis on laisse sécher à l’air.

Pour colorer, on recouvre ensuite la préparation d’une solution aqueuse saturée de bleu de méthylène, de fuchsine ou de violet de gentiane; cette solution doit être filtrée au moment de l’emploi. Après quelques instants de contact, on jette l’excès de colorant, on lave

d/U NOTIONS DID TECHNIQUE MICROBIOLOGIQUE

à l’cau eL on fait sécher. Si la coloration est insuffisante, on recommence en prolongeant un peu le temps de contact avec la matière colorante.

Double coloration

468. — Dans certains cas, il peut être avantageux (le faire une double coloration, par exemple lorsque l’on veut faire apparaître nettement des noyaux ou des spores, ou encore pour différencier des espèces bactériennes dans un mélange. 11 ne s'agit pas de reproduire ici les innombrables techniques qui sont utilisées en bactériologie, mais d’indiquer simplement le principe des doubles colorations, au moyen de quelquesexemples simples. D’une manière générale, on teinte d’abord l’ensemble de la préparation, fixée au préalable, par un colorant approprié ; on traite ensuite par un agent de différenciation. En plaidant la préparation dans un second colorant, celui-ci ne se fixera que sur les parties précédemment décolorées. On choisit les deux couleurs de manière à avoir un contraste très net : violet et rouge, bleu et rouge, rouge et vert, etc.

469. — Un premier exemple très simple de double coloration est celui des cellules nucléées. On sait que la chromatine des noyaux fixe énergiquement les matières colorantes dites basiques : bleu de méthylène, fuchsine, etc. Si on traite d'abord la préparai ion par un colorant acide, comme l’éosine, l’ensemble est coloré d’une manière dilfuse. En faisant alors agir un colorant basique, celui-ci déplace le premier pour se fixer élec-

DOUBLE COLOBATION

tivement sur le noyau de la cellule; la double coloration esl ainsi obtenue sans différenciation ni décoloration spéciales.

Les hématies nucléées du sang des oiseaux ou des reptiles se prêtent parfaitement bien à cette technique. On opérera de la manière suivante : un pigeon étant piqué à la grosse veine qui suit le bord de l’aile, on dépose une goutte du sang qui s’écoule sur une lame de verre bien propre ; on étale vivement avec le bord d’une carte de visite, que l'on fait glisser à la surface de la lame, tout en soufflant pour obtenir une dessiccation rapide. La préparation est alors fixée à l’alcool absolu (que l’on renouvelle une à deux fois) pendant cinq à dix minutes. On recouvre ensuite avec une solution aqueuse d’éosine à 0,5 "/„, pendant une minute environ ; ce colorant est alors jeté et remplacé par la solution aqueuse saturée de bleu de méthylène, dont l’action doit durer à peu près trente secondes. On lave aussitôt à l’eau distillée, tant que celle-ci se colore d’une façon visible, on sèche et on examine au microscope (obj. 5 ou 8, oc. 2). Les hématies sont colorées, le noyau en bleu, le protoplasma en rose.

470. — Nous choisirons comme second exemple celui de la coloration des spores. La spore bactérienne est en général difficile à colorer et, pour y arriver, il est nécessaire de traiter préalablement par un mordant. Lorsque la coloration est obtenue, elle est également très difficile à enlever ; les réactifs décolorants la respecteront et, en traitant par une seconde matière colorante convenable, cette dernière teindra les bactéries; on obtiendra ainsi la double coloration cherchée.

On peut éludier celle coloralion sur un fragment de voile de Bacülits subtilis de vingl-qualre à quaranlehuil heures, qui renferme des bacilles sporulés (§ 463), ou sur une préparation provenant d’une culture de ferments butyriques du sol âgée de deux à trois jours (§ 486).

On étale une goutte de culture (ou un fragment de voile, dissociédans une goutte d’eau) sur une lame, on laisse sécher, et on fixe à l’alcool-éther pendant deux à trois minutes. On dépose sur la préparation quelques gouttes d’une solution d’acide chromique à o % et on laisse agir ce mordant pendant cinq minutes; on lave à l’eau, on Averse plusieurs gouttes de solution phéniquée de fuchsine ('), de manière à couvrir complètement la préparation, et on chaude au-dessus d’une petite flamme jusqu’à émission de vapeurs, pendant cinq à dix minutes, en ajoutant de temps à autre quelques gouttes de colorant, de façon à ce que la prépai'ation ne so\i j amais à sec. On lave alors à grande eau pour enlever l’excès de couleur, et on dilTérencie en plongeant la lame pendant trente secondes à une minute dans une solution aqueuse de chlorhydrate d’aniline à 2 On lave à l’alcool à 96”, qui décolore toute la préparation, à l’exception des spores. On examine au microscope; si la décoloration est incomplète, on traite à nouveau par le chlorhydrate d’aniline et d’alcool.

La lame est alors recouverte de solution aqueuse de

(') Celte solution, dite fuchsine de Ziehl, se prépare en mélangeant 10 centimètres cubes d'une solution à 10 «/„ de fuchsine dans l’alcool à 96° avec 90 centimètres cubes de solution aqueuse de phénol ordinaire à 1 ou 2 o/q. On filtre avant remploi.